醫院制劑上感合劑微生物限度檢查方法建立

趙婷 曾博雅 馬佩杰 盧俊瑋 舒文將 強羽菲 鞠依珊△

(1.寶雞市中心醫院,陜西 寶雞 721008;2.寶雞市食品藥品檢驗檢測中心,陜西 寶雞 721013)

醫院制劑主要是針對本院臨床上需求量小、不適合進行工廠批量化生產的品種,控制其質量是確保臨床用藥安全的前提[1]。可以對藥品質量產生影響的因素有很多,作為重要影響因素之一的微生物,對其進行控制是保證藥品質量的重要手段[2]。控制菌檢查法及微生物計數檢查法是檢查非規定滅菌制劑與其原輔料受微生物污染程度的重要方法[3]。口服中藥制劑作為目前常用的醫院內醫療制劑,具有用量大、制作簡單及使用便捷等特點,且因其療效確切深受患者與醫生好評,由于中藥制劑的特殊性,致使其無法像西藥具有嚴格標準的制作流程,因此對醫院內中藥制劑的微生物限度進行檢查常常不合格[4]。由于中藥制劑中含有多種成分,其中任何成分均可對微生物限度檢查結果的準確性產生影響,因此藥品微生物限度檢查所使用的方法應該與其他分析方法一樣被證明是適宜的,才可以確保檢查方法的準確完整[5-6]。微生物方法學試驗即向藥物制劑中加入一定量的試驗菌,驗證檢驗方法是否實用和有效[7]。上感合劑為我院院內特色的口服中藥制劑,因其療效確切、臨床使用廣泛,為對其質量進行控制,確保檢測方法的可靠性,使其微生物限度達到要求[8]。本研究根據2015年版《中國藥典》四部通則規定,對我院院內制劑上感合劑進行微生物限度檢查的方法學驗證試驗,建立了該制劑微生物限度的檢查方法。

1 材料與方法

1.1主要儀器 BHC-1300ⅡA2型生物安全柜(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司);SPX-150型生化培養箱(慧科電子有限公司);KB-240型生化培養箱(德國BINDER公司);YXQ-LS-100SⅡ型立式壓力滅菌器(上海博訊實業有限公司醫療設備廠);BSA2202S電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);VITEK2全自動微生物鑒定藥敏系統法國梅里埃有限公司);Olympus顯微鏡(日本奧林巴斯公司)[9]。

1.2材料

1.2.1供試品 上感合劑(批號:190527,規格:200 ml/瓶),由我院制劑室提供。

1.2.2菌種 大腸埃希菌[CMCC(F)44102]、銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501][10-15]、 黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001][1,6]。以上試驗用菌株均為第3代,且來自于中國醫學細菌保藏管理中心。

1.2.3培養基及稀釋液 胰酪大豆胨液體培養基(批號:1703082)、沙氏葡萄糖液體培養基(批號:180420)、麥康凱液體培養基(批號:180711)、胰酪大豆胨瓊脂培養基(批號:1703232)[1,8-9,14]、沙氏葡萄糖瓊脂培養基(批號:180301)、麥康凱瓊脂培養基(批號:180207)、PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號:1806222)。以上培養基均由北京三藥科技開發公司生產,適用性檢查符合要求。

1.3方法

1.3.1菌液的制備 分別將大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄菌接種于胰酪大豆胨液體培養基中,置于33℃培養箱中,培養20 h[5-6,10-11,14,16-19],用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌量為103～104cfu/mL的混懸液。將白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養基中,置于23℃培養箱中,培養3 d[10,14,16],用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成含菌量為103～104cfu/mL的混懸液。將黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基中,置于23℃培養箱中,培養5 d,加入5 mL含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液,洗脫孢子,收集孢子懸液,制成含霉菌孢子數為103～104cfu的黑曲霉孢子混懸液。

1.3.2培養基稀釋法制備供試液 取兩瓶上感合劑,混合均勻,作為供試品原液。量取10 mL供試品原液,加100 mL胰酪大豆胨液體培養基,振搖,使其分散均勻,制成1:10的供試液。

1.3.3需氧菌、霉菌和酵母菌總數計數方法學驗證試驗 (1)試驗組:量取制備好的1:10供試液分裝于5個無菌試管中,每管分別為9.9 mL,再分別加入制備好的含菌量為103～104cfu/mL的枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌及黑曲霉菌懸液0.1 mL,含菌量不大于100 cfu,混勻[10,12,16]。(2)供試品對照組:量取制備好的1:10供試液9.9 mL,加入0.1 mL PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液,混勻。(3)菌液對照組:量取PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液分裝于5個無菌試管中,每管分別為9.9 mL,操作同試驗組。(4)陰性對照組:用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液及供試品,操作同試驗組。(5)平皿傾注法對供試品微生物回收:量取1 mL制備好的試驗組供試液,置于直徑90 mm的無菌平皿中,注入20 mL溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養基或沙氏葡萄糖瓊脂培養基,混勻,待凝固,胰酪大豆胨瓊脂培養基倒置于33℃培養箱中培養5 d,沙氏葡萄糖瓊脂培養基倒置23℃培養箱中培養7 d,分別進行計數。供試品5種試驗菌的回收率均需進行3次重復試驗,計算平均菌落數[9-10]。同法對菌液對照組、供試品對照組及陰性對照組的菌落數進行測定。

1.3.4控制菌大腸埃希菌的檢查方法學驗證試驗 (1)試驗組:量取1:10供試液10 mL接種于胰酪大豆胨液體培養基100 mL中,同時接入大腸埃希菌含菌量不大于100 cfu,混勻,置于33℃培養箱中培養18 h[10]。(2)供試品對照組:量取10 mL 1:10供試液,以稀釋液PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液,操作同試驗組。(3)陰性對照組:以稀釋液PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液與供試液,操作同試驗組[8]。(4)選擇和分離培養:分別量取1 mL上述三組培養物接種至100 mL麥康凱液體培養基,置于43℃培養箱中培養24 h,將麥康凱液體培養物劃線接種于麥康凱瓊脂培養基平皿上,置于33℃培養箱中培養18 h,觀察[10,14,16-17]。

2 結 果

2.1需氧菌、霉菌和酵母菌總數計數方法學驗證試驗結果 結果判定:回收率(%)=(試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/菌液對照組平均菌落數×100%[20-21],若回收率在0.5～2.0范圍內[22],上感合劑的需氧菌、霉菌和酵母菌總數計數的方法學驗證試驗合格[11,14,16,19]。結果顯示:本批次上感合劑,采用培養基稀釋法進行測定銅綠假單胞菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌的回收率均在0.5～2.0范圍內[22],提示上感合劑的需氧菌、霉菌和酵母菌總數計數檢查方法學驗證合格[8-10,12,15-16]。見表1、表2。

2.2控制菌大腸埃希菌的檢查方法學驗證試驗結果 結果判定:若菌液組能檢出大腸埃希菌,供試品對照組與陰性對照組均未檢出,可判定上感合劑的控制菌大腸埃希菌的檢查方法驗證試驗合格[15]。結果顯示:供試品對照組與陰性對照組均未檢出試驗菌,而試驗組檢出試驗菌,檢出的試驗菌經鑒定為大腸埃希菌,提示上感合劑的控制菌檢查方法驗證合格。見表3、表4。

表3 控制菌(大腸埃希菌)檢查方法學驗證試驗結果Ⅰ

表4 控制菌(大腸埃希菌)檢查方法學驗證試驗結果Ⅱ

3 討 論

微生物限度檢驗需確認供試品在該檢驗條件、檢驗量下無抑菌活性或者抑菌活性已經被充分消除,才可以保證檢驗結果能真實的反映制劑受微生物污染的情況[23]。但由于中藥制劑通常成方藥味較多,藥不同抑菌活性強度不同,檢驗具有較強抑菌活性的制劑時,試驗過程中首先選擇方便有效的培養基稀釋法,醫院制劑上感合劑中含有連翹、金銀花等中藥,且金銀花含有的綠原酸成分具有極強的抗菌及抗病毒功能[24-26],連翹作為廣譜抗菌藥,可抑制多種細菌[27],但表1、2試驗結果顯示,含有連翹、金銀花的上感合劑對藥典規定驗證用的5種試驗菌株(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉)抑菌作用較小,且回收率均在0.5～2范圍內[22],這可能是由于具有復雜成分的復方中藥制劑,在煎煮過程中,其中的某些藥物化學成分,受到空氣中的氧、熱、水的影響,不同組分之間產生了化學變化及相互作用,其生物活性與物理性質發生改變[28],并且由于中藥復方的配伍不僅只是藥物數量上的簡單相加,而是通過藥物之間的相互配伍發生了質的改變[29]。這些均導致含有抑菌作用連翹、金銀花的上感合劑僅使用簡單的培養基稀釋法就能有效的將供試品的抑菌作用消除。因此,培養基稀釋法對供試品進行處理可滿足該制劑對需氧菌、霉菌和酵母菌總數進行計數的需要。

按照微生物限度檢查方法驗證試驗,可將驗證菌株分別于樣品環節、供試液制備環節及最后環節進行加入,進行回收率測定[30]。綜合考慮實驗方案的可行性,以及樣品與操作過程的影響因素,最合理的加菌方式為供試液制備階段加菌[30]。本試驗優先選擇文獻報道[30]的在供試液制備環節加菌,通過表1、2試驗結果可知,5種試驗菌株的回收率均在0.5～2范圍內[22],滿足藥典對驗證試驗的微生物回收率規定,因此采用供試液制備環節加入試驗菌是合理且可行的。通過表1、2試驗結果可知,采用平皿傾注法對藥典中規定驗證用的5種試驗菌株回收率均在0.5～2范圍內[22],滿足藥典對驗證試驗的微生物回收率規定,因此,采用平皿傾注法對微生物進行回收方法準確有效且操作簡便。通過表3、4試驗結果可知,采用平皿法對控制菌進行檢查,試驗組中菌生長良好,陰性對照組未檢出。藥典對控制菌檢查方法驗證需要設立供試品對照組并沒有進行明確規定,本試驗通過設立供試品對照組為了證明供試品是否被污染,保證結果的可靠性,如表3結果顯示:供試品對照組未檢出控制菌,既證實了供試品未被污染,也證明了此方法的可靠性及可行性,符合藥典的規定。供試液從制備到加入培養基的時間若超過1 h,即有可能導致微生物的大量繁殖或者死亡,從而影響微生物計數的結果。同時,若制備供試液需水浴加熱及培養基需保溫,溫度均不應超過45℃,且對供試液進行水浴加熱的時間也不應超過30 min,避免長時間加熱對結果產生影響。

綜上所述,上感合劑微生物限度檢查方法驗證試驗符合2015年版《中國藥典》四部通則要求,建立的方法準確可行,可用于上感合劑的微生物限度檢查,同時,可以為醫院口服中藥制劑的微生物限度檢查方法建立提供參考[8-9,11]。