基于HS-SPME-GC-MS對祿豐香醋揮發性風味物質及成分分析

趙銳環,陳乾睿,安梅,李桂蘭,康小艷,徐志強 *

(1.云南農業大學 食品科學技術學院,昆明 650201;2.云南農業大學云南省畜產品加工工程技術研究中心,昆明 650201)

食醋大多是以谷物或水果為基本原料,經微生物相互作用發酵而成的一種液態產品[1],通常被用作酸味調味,其口感豐富、風味獨特。

我國傳統食醋獨具風味、種類繁多、各具特色,其中山西老陳醋、四川閬中保寧醋、福建永春老醋和江蘇鎮江香醋被譽為我國的“四大名醋”,發酵方式為固態發酵的酸醋種類有山西老陳醋、四川閬中保寧醋、江蘇鎮江香醋,福建永春老醋為液態靜置發酵。祿豐香醋又稱發酵米醋,是原產于云南省楚雄市祿豐市的一種發酵米醋,原料使用了糯米,通過酒曲的糖化,黑曲、酵母、米曲、紅曲的后糖化、酒化、醋化發酵等工序制成[2]。微生物在發酵過程中的來源多種多樣,來源于麩皮、谷殼以及周圍的環境,而且通過微生物自身的生存進化以及環境的適應,使發酵過程中的微生物種類處于動態平衡的同時,不斷使淀粉發生糖化、酒化、醋化,形成頗有祿豐特色的地方發酵產品。由于對祿豐香醋的研究大部分集中在其傳統工藝的優化和改進方面,而對其風味成分的研究鮮有報道。

當前,對揮發性成分分析的方法多種多樣,各有優缺點。其中液液萃取(LLE)分離效果最好,但消耗試劑量多[3];固相萃取(SPE)試劑用量少,但操作步驟多,且回收率較低[4];固相微萃取(SPME)不用有機溶劑,但萃取材料的量少[5];頂空固相微萃取(HS-SPME)操作步驟簡單、重現性好,但運用的范圍窄[6];攪拌棒吸附萃取(SBSE)回收率高、重復性好,但設備價格昂貴[7]。因此對食醋中揮發性風味物質的研究大多采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS),集采樣、萃取、進樣于一體,加快了分析檢測速率。李攀恒等[8]采用HS-SPME結合GC-MS測定山西老陳醋中的揮發性香氣物質,共檢測出80種,分別為酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、吡嗪類和其他類;鄭戰偉等[9]采用HS-SPME-GC-MS對山西老陳醋、江蘇鎮江香醋、四川閬中保寧醋和福建永春老醋4種具有代表性的食醋香氣成分進行分析,得到多種香氣化合物。其中檢測得到的香氣化合物種類較多的是山西老陳醋,對應的酯類和雜環類化合物的種類和數量也最多。研究表明固態發酵醋的香氣成分種類數遠遠高于液態發酵醋,這與姚金霞等的研究結果相似[10-11],同時發現食醋的香氣化合物與發酵年份有關,年份越久,香氣化合物的種類越多。

在此基礎上,本研究探究了不同年份祿豐香醋的理化品質,利用HS-SPME-GC-MS檢測技術對祿豐香醋的揮發性風味物質進行檢測,并利用正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA)和變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)解析不同年份祿豐香醋樣品中的主要風味物質,為提升祿豐香醋的風味品質提供了一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同年份祿豐香醋樣品:均來自祿豐香醋廠;葡萄糖、硫酸銅、氯化鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、酒石酸鉀鈉、磷酸、鹽酸(均為分析純):購于上海源葉生物科技有限公司;2-辛醇(色譜純):購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B-5977B GC-MS聯用儀、 DB-Wax色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm) 美國 Agilent 公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;HANNA HI9025 pH計 北京億賽得科技發展有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 理化指標的測定

還原糖含量:參照GB 5009.7—2016測定;氨基酸態氮含量:參照GB 5009.235—2016以及杜善良等[12]的方法測定;pH值:采用pH計測定。

1.3.2 SPME-GC-MS 檢測方法

SPME條件:取醋樣100 μL于20 mL 頂空瓶中,再加入10 μL 2-辛醇并密封。水浴(60 ℃、15 min),將萃取頭插入頂空瓶中(60 ℃、30 min),取出后插入GC 進樣口,20 ℃下解吸 4 min,進行GC-MS 分析。

GC條件:色譜柱采用 DB-Wax(30 m×250 μm×0.25 μm),進樣口溫度250 ℃,不分流進樣,載氣為氦氣,恒流模式;柱流速1 mL/min;程序升溫(40 ℃、4 min),以 5 ℃/min升到245 ℃,保持5 min。

MS條件:電子電離源溫度230 ℃;四極桿溫度150 ℃;質量掃描范圍(m/z)20～400 Da。

使用LECO Chroma TOF V4.3X軟件,和NIST數據庫對質譜數據進行分析。

1.3.3 醋樣香氣成分半定量分析

采用內標法對風味物質進行半定量分析,以2-辛醇為內標物。

1.4 數據分析

采用Origin 8.5和Excel對實驗數據進行處理、分析以及圖形繪制;采用SPSS 20.0進行差異顯著性分析,P<0.05表示差異顯著;采用SIMCA-P進行OPLS-DA和VIP值分析。

2 結果與分析

2.1 祿豐香醋理化指標分析

4個不同年份祿豐香醋的理化指標見表1。

表1 祿豐香醋理化指標分析結果

總酸在一定程度上能夠反映酸醋的質量[13],祿豐香醋的pH為4.60～4.70,總酸為0.51～0.54 g/100 g,且兩者之前存在一定的相關性,總酸與pH呈負相關,這與張林祥等的研究結果一致,祿豐香醋的pH高于鎮江香醋的pH(3.60～3.90)[14],低于赤水曬醋的pH(5.75～6.20)[15],這可能與發酵的原料、發酵時所選用的微生物、發酵場地和儲存時間的差異有關。

還原糖在發酵過程中為微生物提供能量,發酵前期大量利用還原糖,隨著發酵速度的減緩,還原糖在后期含量保持穩定[16],同時還原糖還能調節發酵醋柔和的口感[17]。祿豐香醋的還原糖含量為1.2～1.4 g/100 g,與Wu等[18]測定鎮江香醋的研究結果類似,還原糖含量也是1.2～1.4 g/100 g。發酵醋中的氨基酸態氮是指以氨基酸形式存在的氮元素,發酵醋的品質受到該含量的影響,含量越高,表明發酵醋的鮮味越濃郁[19]。4個醋樣中的氨基酸態氮含量為0.39～0.42 g/100 g,山西老陳醋的氨基酸態氮含量為0.21 g/100 g[20],鎮江香醋的氨基酸態氮含量為0.28～0.30 g/100 g。祿豐香醋的氨基酸態氮與鎮江香醋的類似,可能與它們所使用的原料都是糯米有關,山西老陳醋的原料是大麥和豌豆[21]。

2.2 祿豐香醋香氣成分分析

為評價4個不同年份祿豐香醋的香氣成分差異,采用 HS-SPME-GC-MS 分析鑒定祿豐香醋揮發性化合物成分以及含量,結果見圖1和圖2。

圖1 不同年份揮發性物質種類和含量

圖2 不同年份總揮發性物質含量

不同年份祿豐香醋揮發性成分分析結果見表2。

表2 不同年份祿豐香醋揮發性成分分析結果

在一定程度上,樣品的風味特征取決于揮發性化合物的組成和含量[22]。4個不同年份的樣品中共檢測到120種化合物,包括9種醇類物質、21種醛類物質、7種酸類物質、24種酯類物質、17種酮類物質、7種酚類物質、11種烷烴類物質、3種烯烴類物質以及21種雜環類物質。4個不同年份祿豐香醋中揮發性成分各組分含量占比在一定程度上存在差異,其中酸類、酯類、醇類、酮類以及雜環類在不同年份祿豐香醋的所有揮發性化合物中占比較高。2017年的祿豐香醋揮發性化合物含量最高,為(86.65±8.33) μg/L,2018年、2019年、2020年的祿豐香醋揮發性化合物含量分別為(76.35±5.95),(68.71±7.51),(64.75±11.96) μg/L,表明揮發性化合物的種類、含量與年份有關,這與杜大釗等[23]采用SPME-GC-MS技術解析四川麩醋及其陳釀過程中揮發性成分的研究結果類似。

酸類的產生與醋酸發酵階段有關,原料中的碳水化合物在酶和微生物的作用下轉化為酸,一部分氨基酸降解也會產生酸[24]。同時酸類也是食醋重要的組成部分,占祿豐香醋香氣成分的26%～41%,賦予祿豐香醋特定的風味及感官屬性。其中含量最多的是乙酸、異戊酸,這與孫宗保等[25]采用基于GC-O-GC聯用技術分析4個醋齡鎮江香醋揮發性成分的研究結果一致,表明乙酸是食醋中的主要風味物質。其中在2020年的祿豐香醋中異戊酸的含量為(8.19±0.58) μg/L,其余年份的含量都在9 μg/L以上,這與簡東振等[26]的研究結果類似,表明異戊酸的產生會受到陳釀時間的影響。

醛類物質是在酒精發酵階段或陳釀階段由醇或酸的縮合反應產生的[27],占祿豐香醋香氣成分的6%～9%,其中異戊醛、苯乙醛、糠醛的含量較多。在陳釀過程中,糠醛、異戊醛的產生與氨基酸脫氨、脫羧有關,其含量與陳釀時間相關,苯乙醛的形成與氨基酸的代謝密切相關[28]。

醇類物質是酵母作用下氨基酸的代謝物[29],占祿豐香醋香氣成分的11%～16%,其中乙醇、苯乙醇、2-甲基丁醇、2,3-丁二醇的含量較多,由大多數微生物分解糖苷類、氨基酸和脂肪酸產生,大多發生在酒精發酵階段[30]。祿豐香醋中的主要醇類物質與張奶英[31]采用SPME-GC-MS技術分析四川麩醋發酵及陳釀過程中揮發性物質的動態變化的研究結果一致,2,3-丁二醇能增加祿豐香醋的香味,由于醇類物質是在微生物的作用下產生的,醇類物質的生成與釀造、陳釀過程中微生物的豐富度有關。

酯類物質的生成主要在酒精發酵、醋酸發酵以及陳釀階段,由醇與相應的酸或輔酶縮合而成,其中酯的含量受水分含量和酯類前體物質濃度的影響[32],占祿豐香醋香氣成分的12%～21%,其中乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、丙位壬內酯含量較多。酯類物質會產生令人愉悅的水果香味[33],對醋的香氣成分起到重要的影響作用。

酮類物質是一種發酵副產物,在酒精和醋酸發酵過程中產生[34—35],占祿豐香醋香氣成分的3%～12%,其中2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、2-丁酮、2-呋喃酮、2-甲基-3辛酮含量較多,它們對醋的香味成分有著重要的貢獻,2,3-丁二酮也是山西陳醋中的關鍵風味物質,是關鍵風味化合物吡嗪的前體[36—37]。

雜環類及酚類物質在祿豐香醋中的含量較少,形成過程較復雜,大部分來自釀造的原料,其中六甲基環三硅氧烷的含量較高,可能會與其他物質雜糅,賦予祿豐香醋獨特的風味,這與王棟等[38]采用HS-SPME-GC技術對鎮江恒順香醋香氣成分進行分析的結果類似。

2.3 不同年份祿豐香醋揮發性成分PCA及OPLS-DA分析

建立OPLS-DA對不同年份的祿豐香醋進行分析比較,OPLS-DA模型中R2X和R2Y表示所建模型對X和Y矩陣的解釋率,Q2表示模型的預測能力,R2和Q2反映模型的好壞。由圖3可知,4組樣品之間有明顯的分開趨勢,其中2017年、2018年聚為一類,表明這2組樣品中揮發性風味化合物對祿豐香醋整體香氣貢獻相似,而2019年、2020年分開聚類,表明這2組樣品的風味化合物對香氣總體貢獻不同于其他2組,可能與風味物質含量較多有關。由圖4可知,累計R2X(cum)=0.7,R2Y(cum) =1,Q2(cum)=0.982,累計R2X(cum)=0.706,R2Y(cum)=1,Q2(cum)=0.975,累計R2X(cum)=0.72,R2Y(cum)=0.999,Q2(cum)=0.976,表明不同年份的祿豐香醋OPLS-DA模型具有良好的穩定性和較好的預測能力。

圖3 不同年份祿豐香醋揮發性成分PCA圖

圖4 不同年份祿豐香醋揮發性成分OPLS-DA圖

2.4 不同年份祿豐香醋揮發性成分VIP 分析

由圖5可知,變量投影重要性(VIP)可以量化OPLS-DA的每個變量對各組樣本分類的判別,當VIP>1時,表明對組間分離具有重要貢獻,其值越大,變量在不同年份祿豐香醋組間的差異性越明顯。通過分析,共篩選出12種代謝物作為潛在的揮發性特征標志物,包括酮類2種、酯類4種、醇類1種、酸類3種、醛類2種,與史玉等[39]的研究結果類似。其中,酯類物質的種類較多,酯類物質一般具有令人愉悅的水果香味,對原醋最終的風味有著極顯著的影響[40]。其次是酸類物質,它與其他成分相互作用、相互調節,共同構成祿豐香醋獨特的風味[41]。

3 結論

本研究分析和比較了不同年份祿豐香醋的理化特性和揮發性風味物質。結果表明,不同年份祿豐香醋的還原糖含量和總酸含量無顯著性差異,pH、氨基酸態氮含量存在差異。4個不同年份的樣品中共檢測到120種化合物,包括9種醇類物質、21種醛類物質、7種酸類物質、24種酯類物質、17種酮類物質、7種酚類物質、11種烷烴類物質、3種烯烴類物質以及21種雜環類物質,各組分含量占比存在差異,但組分含量最多的包括乙酸、異戊酸、異戊醛、苯乙醛、糠醛、乙醇、苯乙醇、2-甲基丁醇、2,3-丁二醇、乙酸苯乙酯、乙酸乙酯、乙酸甲酯、2-羥基-4-甲基戊酸乙酯、丙位壬內酯、2,3-丁二酮、2,3-戊二酮、2-丁酮、2-呋喃酮以及2-甲基-3辛酮。PLS-DA結合VIP值判斷乙醇、2,3-丁二酮、異戊酸、苯乙醛、乙酸乙酯、乙酸異戊酯是造成不同年份祿豐香醋風味差異的物質。