基于模糊綜合評價法對不同部位牦牛肉特征及揮發性化合物成分分析

張浩,鄧靜,唐英明,陳勝利,喬明峰,白婷,張振宇*

(1.四川旅游學院 烹飪學院,成都 610100;2.四川旅游學院烹飪科學四川省高等學校重點實驗室,成都 610100;3.肉類加工四川省重點實驗室,成都 610106)

青海地區牦牛主要生長在4 000～4 500 m的高海拔、高山草原地區[1],通過半野化放牧以及畜種改良、優化,目前培育出“野血牦牛”[2]。高原草飼牦牛肉脂肪低,富含蛋白質、氨基酸以及鈣、磷等微量元素[3],對提高人體免疫力具有顯著作用。高原草飼散養牦牛因其運動機能不同,不同部位的肌肉品質差異明顯,需要辨別不同部位化合物成分才能分辨出青海牦牛肉特征和揮發性化合物成分。

目前關于牦牛的研究主要集中在牦牛肉營養成分[4]、品質差異[5]、牦牛飼養[6]、品質及感官特性的影響[7]、微生物多樣性[8]、屠宰方法[9]、氨基酸及風味分析[10]等方面。對于揮發性化合物成分分析的相關研究并不多見,特別是對青海玉樹地區高原、草飼、野血牦牛肉的化合物成分分析、特征差異等方面的研究非常少。感官評價是評價食品優劣的常見方法[11],但其主觀性、嗜好性強,重復性差,而采用模糊綜合評價方法(fuzzy comprehensive evaluation method)對感官評價進行定量化和數學化的描述和處理已經在食品的感官評定中得到了廣泛應用[12];電子鼻(electronic nose)能模擬人類嗅覺,其檢測結果客觀、重復性好[13];固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用(SPME-GC-MS)技術是分離、鑒定復雜有機物的技術,主要檢測小分子揮發性物質[14],二者數據融合分析可以明確揮發性化合物成分,并分析其相關性和差異性。

本文擬以不同部位牦牛肉為研究對象,采用模糊綜合評價進行感官評價,運用電子鼻、SPME-GC-MS、主成分分析、聚類分析、熱圖分析、相關性分析等方法,分析青海牦牛不同部位肌肉揮發性化合物整體信息,辨別出不同部位牦牛肉化合物成分的相關性與差異性,為今后牦牛肉的風味評價研究提供了參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青海牦牛(由青海圣潔高寒農牧科技有限公司提供的2.5齡牦牛),低溫排酸24 h、熟成36 h后,取胴體左側5個部位肌肉,冷凍后真空包裝,運送到實驗室,解凍到室溫25 ℃。樣品具體信息見表1。

表1 青海牦牛肉部位樣品分類

FOX4000電子鼻 法國Alpha MOS公司;SQ680氣相色譜-質譜聯用儀、色譜柱Elite-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm) 美國PerkinElmer公司;75 μm CAR/PDMS手動萃取頭 美國Supelco公司;15 mL頂空瓶 北京譜朋科技有限公司;BT423S電子天平 德國賽多利斯公司;其他為實驗室常用設備。

1.2 實驗方法

1.2.1 感官評價

參考韓冬潔等[15]的模糊綜合評判法在牦牛肉感官評定中的應用,制定評分標準,見表2。

表2 鮮牦牛肉感官評分標準

由10位食品感官評價的專業人員組成評定小組,首先對評定人員開展感官培訓,包括肉類外表色澤、水分黏度、嗅聞氣味和觀察肌肉組織的具體方法,對評價結果進行模糊綜合評價。模糊綜合評價法是應用模糊系統的原理,將原先較模糊的因素進行量化,變為數據,稱為去模糊化,再利用多個因素對被評判事物的隸屬度等級狀況進行綜合評判的方法。

1.2.2 電子鼻

樣品處理:將牦牛肉剔去筋膜、剁細,精確稱量2.00 g樣品,放入10 mL頂空進樣瓶中,密封,編號待檢。

分析條件:頂空溫度50 ℃,時間300 s,進樣量500 μL/s,數據采集時間120 s,采集延遲180 s。樣品測定9組,取3組相對穩定的結果分析。

1.2.3 固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用

參考張愛萍等[16]的方法,樣品處理:將牦牛肉剔去筋膜、剁細,精確稱量4.00 g 樣品,放入20 mL頂空進樣瓶中,加入適量飽和純鹽水,密封,編號待檢。

萃取條件:取樣品于頂空瓶中,在55 ℃恒溫水浴30 min,將75 μm CAR/PDMS手動萃取頭插入頂空瓶中吸附30 min,將進樣針插入GC-MS進樣口,解吸600 s。

GC條件:色譜柱Elite-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);升溫程序:起始溫度40 ℃,保持3 min,以5 ℃/min升至60 ℃,以10 ℃/min升至120 ℃,以15 ℃/min升至250 ℃,保持3 min。載氣:氦氣(99.999%),流速1 mL/min,分流比10∶1。

MS條件:EI離子源,電子轟擊能量70 eV,離子源溫度230 ℃,全掃描,質量掃描范圍(m/z)30～600;標準調諧文件。

定性、定量分析:揮發性成分歸一化定性、定量以檢索NIST 2011譜庫,計算其保留指數并與其他文獻值進行比對,同時結合人工解析質譜圖進行確定。

1.3 數據處理

數據處理和分析采用Excel 2007,顯著性(P<0.05表示有顯著差異)分析采用SPSS 25,作圖采用Origin 2021。

2 結果與分析

2.1 感官評價結果

綜合評價集V={v1,v2,v3,v4},v1,v2,v3,v4分別代表優、良、中、差;

隸屬因素集U={u1,u2,u3,u4},u1,u2,u3,u4分別代表色澤、水分、氣味、組織;

因素權重集合模糊集A={ɑ1,ɑ2,ɑ3,ɑ4},ɑ1,ɑ2,ɑ3,ɑ4分別代表肉類感官評價影響程度,最終設定為ɑ1=0.30,ɑ2=0.15,ɑ3=0.20,ɑ4=0.35。

根據模糊綜合評價法,進一步構建評價矩陣并計算綜合隸屬度,根據綜合評分進行感官評價[17],根據10個評分人員的綜合結果得出表3和5個模糊矩陣。

表3 不同部位牦牛肉模糊評判矩陣

表4 牦牛肉感官評分結果

權重集合:A={0.30,0.15,0.20,0.35},綜合評價集V={3,5,7,9};

矩陣運算:R=(Rj×A)/10={1.09,0.955,1.055,0.955,1.08};

R×V={6.5,5.73,6.33,5.73,6.48}。

模糊綜合評分結果:{6.5,5.73,6.33,5.73,6.48},得分順序:樣品A>E>C>B=D;其中樣品A、E、C(評分在5～7之間,偏向于7;品質在良和中之間,偏向于良)模糊數學評定優于樣品B、D(評分在5～7之間,偏向于5;品質偏向于中,且得分相同,品質相似)。

2.2 電子鼻結果分析

電子鼻雷達圖見圖1。

圖1 電子鼻雷達圖

由圖1可知,LY2/LG、LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCT1 和LY2/gCT 傳感器信號強度差異不明顯,其余12根傳感器信號強度差異較明顯;樣品A在傳感器T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2上與其他樣品表現出明顯差異,完全獨立于其他樣品。有研究表明,這類感應器對極性化合物、非極性化合物、甲苯、醛類、乙醇較敏感,這可能與樣品中含有大量醇類、醛類物質有關[18]。

電子鼻主成分分析圖見圖2。

圖2 電子鼻主成分分析圖

由圖2可知,PC1貢獻率為90.36%,PC2貢獻率為6.02%,說明大量有效信息存在于第一主成分。侯婷婷等[19]研究認為,當PC1 貢獻率遠大于PC2時,說明樣品在橫坐標上距離越大,其差異性越大,而樣品B、C、D均靠近橫坐標,其差異性較小,樣品E距離橫坐標較遠,表現出較大差異,樣品A位于第三象限,氣味獨立于其他樣品。

電子鼻18根傳感器對應的敏感物質類型見表5。

表5 電子鼻18根傳感器對應的敏感物質類型

由表5可知,牦牛肉中苯類、醇類、烯烴類、酮類、硫化氫類、乙醇類的信號強度比較明顯。

2.3 SPME-GC-MS結果分析

2.3.1 化合物成分分析

青海牦牛肉共鑒定出60種化合物,由表6可知,A、B、C、D、E分別含有45,46,41,40,49種化合物,包含醛類、醇類、烴類、酸類、酮類和雜類含硫、醚類化合物。這些肉類化合物成分是風味前體物質,在后期加工過程中通過美拉德反應、脂質氧化、糖類降解轉化為肉類風味物質,其中醛類、酮類、含硫化合物以及雜環類化合物是肉類香氣的主要來源。

由表7可知,牦牛肉化合物成分主要包括醛類含量34.86%～53.65%,醇類含量8.91%～23.66%,烴類含量8.39%～35.98%,酸類含量2.64%～8.52%,酮類含量0.36%～2.04%,雜類含硫、醚化合物3.47%～17.92%,可以確定牦牛肉不同部位化合物成分構成差異較大。

表7 牦牛肉化合物相對含量統計表

醛類化合物是肉類重要的香氣成分,一般來源于不飽和脂肪酸氧化過程或糖類降解過程[20],對肉類風味的影響較大。由表7可知,牦牛肉醛類化合物相對含量最多,其中樣品B醛類(相對含量高達53.65%)是青海牦牛肉主要化合物成分,這與朱青云等[21]得出的醛類是青海牦牛肉中揮發性風味成分的重要組成部分的結論基本相同,且樣品B相對樣品A醛類含量高出65%左右,表明5個樣品醛類含量有差異,B>D>C>E>A。肉類脂肪受熱后產生美拉德反應,香味前體物質轉化為雜環類化合物、醛類、醇類[22],因此脂肪含量較多的部位,如樣品B、D、C,其醛類含量相對較高,而脂肪含量較少的部位,如樣品A、E,其醛類含量相對較低,這與電子鼻主成分數據分析結果相似。

醇類化合物主要是由牛肉脂質降解產生的[23],對牛肉風味的形成具有重要作用。滕迪克等[24]的研究結果表明,醇類化合物在肉類整體風味的形成中發揮了關鍵貢獻,樣品A中2-乙基-1-己醇是其他樣品的3倍,苯甲醇是其他樣品的1～2倍,說明樣品A與其他樣品差異較大。朱青云等[21]研究認為醇類在青海牦牛肉中處于次要地位,主要是因為醇類一般閾值較高。錢敏等[25]研究表明2-乙基-1-己醇含量雖然比較高,但是其香氣閾值也高,對風味貢獻比較小,而樣品A醇類相對含量高出樣品C大約265%,表明醇類相對含量差異較大,A>E>D>B>C,說明不同部位牦牛肉醇類特征差異較大。

烴類化合物是肉類氨基酸、脂肪氧化后期產物[26]。曹偉峰等[27]研究認為烴類是在熟牛肉和生牛肉中發現的含量最多的一類揮發性化合物,但是這類化合物的閾值較低,對肉制品風味的貢獻并不大。樣品C烴類含量是樣品E的428%,呈現顯著差異,C>A>B>D>E。李永鵬等[28]研究表明,牛肉中像甲苯這樣的芳烴氣味與涂料味有關,在牦牛肉成熟后會在一定程度上加強,也就是常見的牦牛肉異味。王惠惠等[29]研究認為此類物質可作為醛類、酮類的前體物質,促進肉產品風味的形成。樣品E烴類含量顯著低于其他樣品,嗅聞氣味也較清淡,這和前面的感官評價結果相似。

酸類化合物一般由相對應的醛類物質經氧化、還原形成[30];樣品E酸類相對含量是樣品B的322%,差異顯著,但青海牦牛肉前期經過低溫排酸,其檢測出的相對含量值均較小,對整體牦牛肉化合物成分的影響不大,E>D>C>A>B。

酮類化合物可由脂肪氧化和美拉德反應產生[31];生肉時對風味的影響相對較小,實驗只檢測出4種(當然也可能是草飼牦牛肉與谷飼牦牛肉脂肪含量差異巨大,作為脂肪氧化后期產物的酮類相對較少),E>D>C>B>A。

雜類含硫、醚化合物對肉類風味起決定作用的是含硫、含氮、雜環類化合物和含羰基化合物[32];樣品E相對含量是樣品B的516%,表現出巨大差異,且樣品E中2-硝基吡啶、2-乙酰吡咯烯丙基甲基硫醚、噻吩、2-乙基呋喃、2-戊基呋喃等相對含量均優于其他部位,特別是2-乙酰吡咯、烯丙基甲基硫醚與其他部位有顯著差異;Smith等[33]研究認為2-甲基呋喃濃度低時具有肉香味和堅果香氣;許多研究證明牛肉“膻味”的成分之一苯酚[34]在高原草飼牦牛肉中僅檢出少量,是青海牦牛肉氣味較好的證明;E>A>D>C>B,其中樣品E相對含量與其他樣品差異顯著。

最終分析結果表明不同部位牦牛肉化合物類別差異顯著。

2.3.2 主成分分析與聚類分析

對牦牛肉化合物相對含量進行歸一化處理,分別做主成分分析圖和系統聚類圖。由圖3可知,PC1貢獻率(59.02%)、PC2貢獻率(27.21%)兩者相加貢獻率大于80%,可以代表樣品揮發性化合物大部分信息。羅楊等[35]研究認為PCA中樣品之間距離近則代表差異小,距離遠則代表差異明顯。樣品B、C位于第二象限,距離相近,化合物成分相似,且相關于醛類、烴類化合物;樣品D位于第一象限,顯著相關于醛類化合物;樣品E靠近X軸,顯著相關于酮類、酸類、雜類含硫、醚化合物;樣品A顯著區別于其他樣品,位于第三象限,靠近Y軸,相關于醇類化合物。由圖4可知,樣品B、C聚類,然后與樣品D聚類,樣品A、E獨立聚類。

圖3 牦牛肉揮發性化合物主成分分析圖

圖4 牦牛肉部位系統聚類圖

2.3.3 熱圖分析

將5個部位揮發性化合物做熱圖。顏色越深表示相關度較高,顏色越淺表示相關度較低,相關數值在0～1之間,不同顏色區域代表差異較大的部分。由圖5可知,一區化合物聚為三類,其中,樣品A顯著相關于醇類、烴類;樣品B、D較相似,顯著相關于醛類、醇類;樣品C顯著相關于烴類,特別是各種含甲苯化合物;樣品E負相關于一區的化合物。二區化合物聚為一類,樣品A、B、C、D呈現顯著負相關,而樣品E在這一區域呈現顯著相關,特別是雜類含硫、醚類化合物、吡嗪、吡咯。三區化合物聚為兩類,樣品A、B、C呈現負相關,樣品D呈現酸類顯著相關,樣品E這一區域呈現顯著相關。四區化合物聚為兩類,樣品A呈現醇類顯著相關,樣品E呈現醇類、苯酚顯著相關,樣品B、C、D呈現負相關。

圖5 5個部位化合物聚類分析熱圖

樣品A顯著相關于化合物甲基-3-丁烯-1-醇、鄰二甲苯、1-戊醇、丁基化羥基甲苯、苯甲醇、2-乙基-1-己醇、2-乙基苯乙酯、1-壬醇、二乙二醇單乙醚;樣品B顯著相關于化合物乙醛、庚醛、間異丙基甲苯;樣品C顯著相關于化合物苯甲醛、間二甲苯、乙基苯、對二甲苯、苯甲酸;樣品D顯著相關于化合物壬醛、辛醛、1-甲氧基-4-甲基苯、庚醛、1-辛醇、癸酸、4-苯基-2-丁酮、2(5H)-呋喃酮;樣品E顯著相關于化合物糠醛、苯乙醛、苯乙酮、3-噻吩甲醛、肉桂醛、十六醛、己酸、2-呋喃甲醇、甲基吡嗪、三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2-乙酰吡咯、2,4,5-三甲基噻唑、3-己酮、二甲基三硫化物、二甲基二硫化物、丁酸、萘、苯酚、烯丙基甲基硫醚、2,4-二叔丁基苯酚、2-乙酰基噻唑。

結果表明,樣品B、D化合物成分相似,樣品A、C化合物有一定差異性和相似性,樣品E化合物成分顯著差異于其他樣品。

2.4 數據融合分析

2.4.1 主要化合物判別分析

選擇每個種類中前5種相對含量較高的化合物進行熱圖分析[36],可以分辨出主要化合物。

由圖6可知,苯甲醛、間二甲苯、壬醛、鄰二甲苯、2-乙基-1-己醇、對二甲苯、苯甲醇、辛醛、1-辛醇、1-辛稀-3-醇、乙基苯、庚醛、己醛、己酸、2-乙酰基吡咯是青海玉樹牦牛肉的主要化合物。其中,樣品A中苯甲醛含量較高,是樣品A的主要化合物;樣品B中苯甲醛、壬醛含量較高,是樣品B的主要化合物;樣品C中苯甲醛、間二甲苯、壬醛含量較高,是樣品C的主要化合物;樣品D中苯甲醛、間二甲苯、辛醛、2-乙基-1-己醇含量較高,是樣品D的主要化合物;樣品E中苯甲醛、壬醛含量較高,是樣品D的主要化合物。分析結果表明,牦牛肉不同部位主要化合物存在相似性和差異性。

圖6 牦牛肉主要化合物熱圖

2.4.2 相關性分析

數據融合分析是將多個傳感器采集的局部、不完整信息或數據加以融合,分析出更正確、可靠的結論[37-38]。采用Pearson線性相關系數分析,將電子鼻傳感器數據與牦牛肉共有化合物進行相關性分析。R代表X軸、Y軸的線性相關程度,絕對值R越大,相關性越強,絕對值R越小,相關性越弱(R值在1～-1之間),其結果見圖7。

圖7 電子鼻數據與主要牦牛肉化合物皮爾斯相關性分析圖

2-乙基-1-己醇、苯甲醇、丁基化羥基甲苯、二乙二醇單乙醚均與P型、T型的全部12根傳感器呈顯著正相關,這兩類傳感器對有機化合物、可燃燒氣體敏感、芳香族化合物、極性化合物敏感,如醇、醚、甲烷、甲苯、二甲苯、乙醇、碳氧基;2-乙酰基噻唑、2,4-二叔丁基苯酚與傳感器P30/2、T40/1、T40/2、TA/2呈正相關,這類傳感器對有機化合物、硫化氫敏感,如硫化物、硫醚;1-庚醇、1-己醇、2-乙酰基噻唑、2,4-二叔丁基苯酚與傳感器LY2/G、LY2/AA、LY2/Gh、LY2/gCT1呈顯著負相關,這類傳感器對有毒氣體、有機化合物、碳氧基化合物敏感[39],如醇、酮、氨、硫化氫;明顯可見化合物與傳感器存在相關性,由相關性分析結果確認電子鼻也能區分化合物成分。

3 結論

模糊綜合評分結果為A>E>C>B=D,樣品A、E、C模糊數學評定優于樣品B、D;電子鼻結果:傳感器信號強度差異明顯,樣品A在傳感器T30/1、P10/1、P10/2、P40/1、T70/2、PA/2上完全獨立于其他樣品;青海牦牛肉共鑒定出60種化合物,醛類含量34.86%～53.65%、醇類含量8.91%～23.66%、烴類含量8.39%～35.98%、酸類含量2.64%～8.52%、酮類含量0.36%～2.04%、雜類含硫、醚化合物含量3.47%～17.92%,確定牦牛肉不同部位化合物差異較大,其中,醛類是青海牦牛肉的主要化合物,醇類起關鍵貢獻;苯甲醛、間二甲苯、壬醛、鄰二甲苯、2-乙基-1-己醇、對二甲苯、苯甲醇、辛醛、1-辛醇、1-辛稀-3-醇、乙基苯、庚醛、己醛、己酸、2-乙酰基吡咯是青海牦牛肉的主要化合物;不同部位化合物存在相似性和差異性,由相關性分析結果確認電子鼻也能區分化合物成分。

研究結果具有一定的切實性,可以為今后牦牛肉風味特征辨別提供理論依據和數據參考。