藻藍蛋白粗提工藝研究

盛晶夢, 張祥霖, 尹 程

(安徽水利水電職業技術學院,安徽 合肥 231603)

藍藻含有豐富的營養物質,其中藻藍蛋白具有顯著的資源化利用潛力。純度越高價值也越高,通常可分為食品級(純度≥0.7)、反應級(純度≥3.9)和分析級(純度≥4.0)三類[1]。藻藍蛋白屬于胞內蛋白質,藻細胞破碎后的溶液中除了藻藍蛋白外還含有大量其他的蛋白質、多糖和脂質等物質[2],其提純通常包括細胞破碎、粗提和純化3個步驟,傳統的方法有超濾法、鹽析法、柱層析法等[3,4]。同時,一些新型的提純方法如雙水相萃取法、利凡諾沉淀法、活性炭吸附法等也為藻藍蛋白的提純拓寬了思路。藻藍蛋白提純技術的關鍵是在兼顧純度和回收率的基礎上探索多種方法的組合使用,以實現簡化操作、縮減成本和縮短周期等目的。利凡諾是一種有機陽離子絮凝劑,在特定條件下通過控制其含量、pH等條件可以選擇性的沉淀某些蛋白質[5]。而活性炭作為一種常見的吸附劑,在水處理中的使用也較多。2種方法所需要用到的儀器設備簡單、操作性強且成本可控。因此,本文選擇通過設置單因素及正交實驗,探究這2種粗提方法的最佳工藝條件,為簡化藻藍蛋白提純操作、實現藍藻規模化處理和改善湖泊富營養化情況提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

藍藻:采用野外新鮮藍藻藻泥(取自巢湖水域),藻體用清水洗凈,然后密封放置于-4 ℃冰箱冷凍保存。

常用試劑:活性炭、HCl、NaOH、PBS緩沖液(濃度為0.002 5 mol/L)、利凡諾等。

1.2 分析方法

(1)藻藍蛋白純度(P)。用紫外可見光分光光度計測定藍藻蛋白溶液吸光度(A)可發現,藻藍蛋白在620 nm處有最大特征吸收峰,總蛋白則在280 nm處有最大吸收峰。由此可以參考Herrera等推薦的公式來計算藻藍蛋白純度。

(1)

其中,A280、A620分別為波長280 nm、620 nm處的吸光度。

(2)藻藍蛋白回收率(Y)。先根據Soni等推薦的公式,計算出藻藍蛋白的質量濃度(C),然后就可以得出藻藍蛋白的回收率。

C=(A620-0.7×A280)/7.38

(2)

Y=(CV/C0V0)×100%

(3)

其中,C為樣品中的藻藍蛋白質量濃度;C0為粗提液中的藻藍蛋白質量濃度;V為樣品溶液的體積;V0為粗提液的體積。

1.3 藍藻細胞破碎與初步處理

1.3.1 藍藻細胞破碎

先將-4 ℃冷凍保存的藍藻藻泥置于室溫(25 ℃)下融解,再置于-4 ℃環境下冷凍,重復2次,完成藍藻細胞凍融破壁操作。最后,用4層普通紗布濾去藻渣,即獲得藍藻細胞破壁液。

1.3.2 利凡諾與活性炭處理效果初步驗證

將上一步所得藍藻細胞破壁液取40 ml分成2組,分別進行如下操作,然后測量所得粗提液的吸光度,初步驗證利凡諾與活性炭的處理效果:

第1組:向細胞破壁液中加入1 ml質量濃度為4 g/L的利凡諾溶液,攪拌均勻,于4 ℃條件下靜置過夜,濾去沉淀后測量吸光度;然后,再加入1 g粉末活性炭,攪拌均勻,靜置5 min后濾去沉淀,取上清液測量吸光度。

第2組:向細胞破壁液中先加入1 g粉末活性炭,攪拌均勻,靜置5 min后濾去沉淀,取上清液測量吸光度;然后,再加入1 ml質量濃度為4 g/L的利凡諾溶液,攪拌均勻,于4 ℃條件下靜置過夜,濾去沉淀后測量吸光度。

1.4 利凡諾處理單因素實驗

通過單因素實驗設計,分別考察不同利凡諾添加量和處理次數對于藻藍蛋白粗提效果的影響。

1.4.1 利凡諾添加量對藻藍蛋白提純效果的影響

取步驟1.3.1所得藍藻細胞破壁液120 ml,分成6組,向每組中分別加入質量濃度為4 g/L的利凡諾溶液0.5 ml、1 ml、1.5 ml、2 ml、2.5 ml、3 ml,攪拌均勻,于4 ℃條件下靜置過夜,濾去沉淀后測量吸光度。

1.4.2 利凡諾處理次數對藻藍蛋白提純效果的影響

取步驟1.3.1所得藍藻細胞破壁液100 ml,分成5組,分別進行如下操作:第1組向溶液中加入質量濃度為4 g/L的利凡諾溶液2 ml(步驟1.4.1中得出),攪拌均勻,于4 ℃條件下靜置過夜,濾去沉淀后測量吸光度;第2組重復第1組的操作2次;后面各組以此類推…第5組重復第1組的操作5次。

1.5 活性炭處理單因素實驗

取適量步驟1.3.1所得藍藻細胞破壁液,按照步驟1.4所得利凡諾沉淀條件4 g/L的利凡諾溶液2 ml,處理2次)處理之后,通過活性炭單因素實驗設計,分別考察不同粉末活性炭粒徑、添加量對于藻藍蛋白粗提效果的影響。

1.5.1 活性炭粒徑對藻藍蛋白提純效果的影響

取上一步驟所得藻藍蛋白粗提液100 ml,分成5組,向每組中分別加入粒徑為Ⅰ(150 μm～75 μm),Ⅱ(75 μm～50 μm),Ⅲ(50 μm～38 μm),Ⅳ(38 μm～31 μm),Ⅴ(<31 μm)的粉末活性炭1.2 g,攪拌均勻,靜置5 min后濾去沉淀測量吸光度。

1.5.2 活性炭添加量對藻藍蛋白提純效果的影響

取藻藍蛋白粗提液120 ml,分成6組,向每組中分別加入粒徑為75 μm～50 μm(步驟1.5.1中得出)的粉末活性炭,0.4 g、0.8 g、1.2 g、1.6 g、2.0 g、2.4 g,攪拌均勻,靜置5 min后濾去沉淀測量吸光度。

1.6 藻藍蛋白粗提處理正交實驗

取步驟1.3.1制備的藍藻細胞破壁液適量,根據單因素實驗結果,選取利凡諾添加量、利凡諾處理次數和活性炭添加量3個因素設計L9(34)的正交實驗進行研究,確定最佳粗提工藝參數。實驗因素水平設置如表1所列。

表1 藻藍蛋白粗提處理正交實驗因素水平表

2 結果與討論

2.1 藍藻細胞破碎與初步處理

如圖1所示,根據第一步操作結果可知,利凡諾和活性炭對于去除藍藻細胞破壁液中的雜質、提升藻藍蛋白純度均有一定的效果,且粉末活性炭處理效果好于利凡諾。這可能是由于利凡諾作為絮凝劑,可以絮凝破壁液中的雜蛋白,降低總蛋白含量的同時使得藻藍蛋白的比重增加;同時,活性炭的多孔結構對破壁液中的小分子有機物、雜質蛋白等都具有較好的吸附效果,而對于大分子的藻藍蛋白則表現出一定的選擇性,使得藻藍蛋白的純度大幅提升。根據第二步操作結果可知,利凡諾和粉末活性炭共同處理藍藻細胞破壁液,藻藍蛋白純度可以進一步提升,而利凡諾沉淀處理與活性炭吸附處理操作的順序先后對于最終提純效果影響不大,考慮到利凡諾可以通過活性炭吸附去除,減少雜質的引入,所以選擇先用利凡諾沉淀,然后用粉末活性炭吸附處理藍藻細胞破壁液。

圖1 利凡諾和活性炭對藻藍蛋白提純效果

2.2 利凡諾處理單因素實驗

2.2.1 利凡諾添加量對藻藍蛋白提純效果的影響

如圖2所示,利凡諾添加量對于藻藍蛋白提純效果的影響表現為,隨著利凡諾添加量的增加,藻藍蛋白的純度總體呈上升趨勢,而回收率則呈下降趨勢。藻藍蛋白的純度在利凡諾添加量為0.5 ml～2.5 ml時明顯增加,2.5 ml時達到峰值,2.5 ml～3 ml時開始有所下降。而藻藍蛋白的回收率則在利凡諾添加量為0.5 ml～2 ml時緩慢下降,2 ml～3 ml時下降趨勢明顯變快。綜合藻藍蛋白的純度和回收率兩個因素,確定質量濃度為4 g/L的利凡諾溶液添加量為2 ml。

圖2 利凡諾添加量對藻藍蛋白提純效果的影響

2.2.2 利凡諾處理次數對藻藍蛋白提純效果的影響

利凡諾處理次數對于藻藍蛋白提純效果的影響如圖3所示,隨著利凡諾沉淀操作次數的增加,總體上藻藍蛋白的純度呈緩慢上升的趨勢,而回收率則緩慢下降。利凡諾沉淀次數在3次以內時,藻藍蛋白的純度增加趨勢明顯,而在第4次和第5次操作后,純度增加不明顯且有所下降。利凡諾沉淀次數在4次以內時,藻藍蛋白的回收率下降趨勢明顯,之后則下降變緩。這可能是由于隨著處理次數的增加,利凡諾在絮凝雜蛋白、提升藻藍蛋白純度的同時,也絮凝了部分藻藍蛋白,使得總蛋白減少的同時藻藍蛋白也有所減少。考慮到需要降低粗提操作的復雜性,并兼顧藻藍蛋白回收率以保障后續提純的效果,確定利凡諾處理次數為2次。

圖3 利凡諾處理次數對藻藍蛋白提純效果的影響

2.3 活性炭處理單因素實驗

2.3.1 活性炭粒徑對藻藍蛋白提純效果的影響

活性炭粒徑對于藻藍蛋白提純效果的影響,如圖4所示,隨著活性炭粒徑的減小,藻藍蛋白的純度明顯增加,回收率下降趨勢則明顯變陡。考慮到保障藻藍蛋白回收率以滿足后續提純操作要求,確定活性炭粒徑為75 μm～50 μm。

圖4 活性炭粒徑對藻藍蛋白提純效果的影響

2.3.2 活性炭添加量對藻藍蛋白提純效果的影響

活性炭添加量對于藻藍蛋白提純效果的影響,如圖5所示,隨著粉末活性炭添加量的增加,藻藍蛋白純度總體呈先增加后降低的趨勢,而回收率則先緩慢降低然后迅速減少。在粉末活性炭添加量為0.4 g～1.2 g時,藻藍蛋白純度快速升高;1.2 g～20 g時,純度增速變緩;2.0 g～2.4 g時,純度開始降低。藻藍蛋白的回收率在粉末活性炭添加量為0.4 g～1.2 g時緩慢降低,在1.2 g～2.4 g時迅速減少。這可能是由于,隨著添加量的增加,活性炭吸附的小分子雜質逐漸增多,藻藍蛋白大幅提升;同時,其孔隙中中孔和大孔的比重也在增大,對藻藍蛋白的不可逆吸附逐漸增強,所以藻藍蛋白的損失量也逐漸增多。綜合藻藍蛋白的純度和回收率兩個因素,確定粉末活性炭添加量為1.6 g。

圖5 活性炭添加量對藻藍蛋白提純效果的影響

2.4 正交實驗結果

根據單因素實驗結果,選取利凡諾添加量、利凡諾處理次數和活性炭添加量3個因素設計L9(34)的正交實驗,對結果用SPSS平臺進行直觀分析和方差分析,確定利凡諾與活性炭粗提藍藻破壁液的最佳工藝條件。正交實驗結果如表2～4所列。

表2 藻藍蛋白粗提處理正交實驗結果

由表3、表4的藍藻破壁液粗提處理極差分析結果可知:

表3 藻藍蛋白粗提處理純度極差分析

表4 藻藍蛋白粗提處理回收率極差分析

由于兩個指標的最佳水平組合有所區別,所以需要對試驗結果綜合分析。對于粗提操作來說,無論是利凡諾處理還是活性炭處理,隨著處理次數或試劑添加量的增加,藻藍蛋白的純度只能在一定程度內有所提高,回收率則會持續下降。粗提操作的目標主要是初步去除雜質,為后續的提純操作打好基礎,所以在追求提高純度的同時更應注重藻藍蛋白的回收率,避免藻藍蛋白的總體產量不高。同時,粗提操作的次數、藥劑添加的量也應優選更少的工藝。所以,本實驗最終選定以藻藍蛋白的回收率為優先考慮指標,在簡化操作、縮短周期、降低成本的考慮下,確定最優工藝參數為:利凡諾添加量2 ml,處理次數為2次,活性炭添加量為1.2 g。

在上述藍藻破壁液粗提操作最優工藝條件(利凡諾添加量為2 ml,處理次數為2次;活性炭粒徑為75 μm～50 μm,添加量為1.2 g)下進行驗證試驗,結果表明:粗提處理后,藻藍蛋白的純度提升至1.67,回收率是61%。

3 結 論

由實驗結果可知,利凡諾和活性炭對于藻藍蛋白的提純均有一定效果。且對單因素和正交實驗結果分析可以得出,藍藻破壁液粗提操作的最優工藝條件是利凡諾添加量為2 ml,處理次數為2次;活性炭粒徑75 μm～50 μm,添加量為1.2 g。相比鹽析、雙水相、柱層析等提純方法,本研究工藝所需設備簡單、試劑較少、操作性強,易于規模化擴大,這為治理水體富營養化、進行藍藻規模化處理開闊了思路。