半夏白術天麻湯下調ApoE-/-小鼠TMAO代謝的作用研究

李繼軍,榮雅琪,孟憲卿,姜月華

血管炎性反應和脂質過氧化沉積導致的血管狹窄是動脈粥樣硬化的主要病理改變。動脈粥樣硬化在中醫理論體系中無對應病名,根據其主要病理變化,多以眩暈、胸痹、痰飲為主進行辨證和對癥治療,總體屬于本虛標實,以肝腎虧虛為本,以痰瘀阻滯為標。脾主運化,若飲食不節,勞逸失度,脾失健運,日久則脾虛濕盛,痰濕蘊結,阻于脈絡,因此,治當燥濕化痰、平肝息風。

氧化三甲胺(TMAO),即三甲胺-N-氧化物(trimethylamineN-oxide),來源于腸道菌群對肉、蛋、奶等富含膽堿類食物的代謝,已證實血液循環TMAO水平與動脈粥樣硬化風險呈正相關[1]。TMAO通過誘導脂肪酸轉運體CD36表達上調,引起膽固醇過量沉積和泡沫細胞形成[2],且TMAO可激活NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)炎性小體,導致內皮通透性增高和促炎性細胞因子白細胞介素-1β(IL-1β)、白細胞介素-18(IL-18)等的釋放,加重血管炎癥反應[3],因此,TMAO近年來被視為是動脈粥樣硬化的促進劑[4]。半夏白術天麻湯(BBTD)是治療痰濕壅盛、風痰上擾的經典名方,功效化痰息風、健脾祛濕,由半夏、天麻、茯苓、橘紅、白術、甘草組成,入選2018年國家中醫藥管理局《古代經典名方目錄(第一批)》。半夏白術天麻湯臨床多用于肥胖性高血壓、頸源性眩暈、急性缺血性腦卒中、梅尼埃病等的治療。有研究報道半夏白術天麻湯通過降血脂、下調基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達,改善載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠動脈粥樣硬化[5]。本課題組既往研究證實,半夏白術天麻湯以劑量依賴性方式減少血管內皮細胞凋亡、改善內皮功能[6],改變了痰濕壅盛證小鼠的代謝模式,降低多種脂質循環水平,減少主動脈根部脂質沉積和斑塊形成[7],且可下調肥胖性高血壓大鼠腎臟CD36的表達[8]。但半夏白術天麻湯參與動脈粥樣硬化的治療及其機制仍有待研究,深入解讀半夏白術天麻湯的血管保護機制具有重要的研究價值和臨床意義。本研究通過檢測半夏白術天麻湯干預后ApoE-/-小鼠血漿TMAO及相關代謝物水平的變化,并同步觀察主動脈CD36、NLRP3的表達及NLRP3下游IL-1β、IL-18表達,探討半夏白術天麻湯改善動脈硬化的藥理作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型誘導

無特定病原體(SPF)級6周齡雄性ApoE-/-小鼠36只,體質量(22±2)g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證編號:SCXK(京)2016-0006。動物房設置12 h∶12 h明暗周期,小鼠自由攝食、飲水,環境溫度20～22 ℃,相對濕度60%。以標準飼料適應性喂養5 d后,高脂高膽固醇飼料喂養12周誘導動脈粥樣硬化模型,然后分為半夏白術天麻湯組[17.8 g/(kg·d)]、瑞舒伐他汀鈣組[0.08 mg/(kg·d)]和ApoE-/-模型組,每組12只,并以相應藥物灌胃8周,灌胃期間仍繼續高脂高膽固醇飲食。另以同周齡標準飼料喂養的12只C57BL/6J小鼠作為C57正常對照組。高脂高膽固醇飼料配方:83.75%基礎飼料,21%脂肪,0.15%膽固醇[3],標準飼料和高脂高膽固醇飼料均購自北京科澳協力飼料有限公司。

1.2 藥物

半夏白術天麻湯組方:半夏 9 g,天麻6 g,白術18 g,橘紅6 g,茯苓6 g,甘草3 g,生姜5 g,大棗兩枚。購自山東中醫藥大學附屬醫院中藥房,水煎2次,2次水煎液混合后濃縮至生藥1 g。

1.3 實驗儀器及試劑

質譜系統為美國AB Sciex公司的4000Qtrap質譜檢測系統,配有電噴霧(ESI)離子源和Analyst 1.6.2工作站;超高效液相色譜儀為Waters UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)液相色譜柱,Waters公司;Analyst軟件(版本號:1.6.2),美國AB Sciex公司;酶標儀Labsystems Multiskan MS 352,芬蘭賽默飛公司;洗 板 機Labsystems AC8,芬蘭熱電公司;TYXH-I漩渦振蕩器,上海汗諾儀器有限公司;TGL-16MS臺式高速冷凍離心機,上海盧湘儀離心機儀器有限公司。兔抗小鼠 CD36 多克隆抗體(18836-1-AP)、兔抗小鼠NLRP3多克隆抗體(19771-1-AP),武漢三鷹公司;山羊抗兔多克隆抗體(ZB-2301),北京中衫金橋公司;鏈霉親和素-生物素(SABC)免疫組化試劑盒(SP-0023),北京博奧森公司;3,3′二氨基苯胺(DAB)顯色試劑盒(ZLI-9031),北京中衫公司;小鼠IL-1β酶聯免疫吸附法(ELISA)試劑盒(210304KE10)、IL-18 ELISA試劑盒(210304KE14),江蘇晶美生物科技有限公司。水合氯醛,北京索萊寶科技有限公司。甲醇、甲酸、水、乙腈均購自CNW公司,L-2-氯苯丙氨酸購自上海恒創生物科技有限公司,LysoPC17.0購自美國Avanti公司。所有化學藥品和溶劑均為分析純或色譜級。

1.4 樣本采集

每天觀察記錄小鼠一般情況。喂養20周后,10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠,下腔靜脈取血,EDTA抗凝,3 500 r/min離心10 min分離血漿,ELISA檢測IL-1β、IL-18含量;并超高效液相色譜-電噴霧離子化串聯質譜聯用(UPLC-ESI-MS/MS)靶向檢測血漿左旋肉堿(L-CA)、甜菜堿(Bet)、膽堿(CHO)、肌酐(Cre)、三甲胺(TMA)、TMAO的水平。冰上分離胸主動脈,10%中性甲醛固定,石蠟包埋,切片厚度4 μm,蘇木素-伊紅(HE)染色觀察組織學改變,馬松染色(Masson)觀察細胞外基質中的膠原沉積從而評價組織纖維化程度;并免疫組化觀察CD36、NLRP3的分布。

1.5 標準液的配制與血漿樣品前處理

超純水分別溶解左旋肉堿、甜菜堿、膽堿、肌酐、三甲胺、TMAO等各標準品至1 mg/mL作為儲備液,依次稀釋至1、2、5、10、20、50、100、200、500 ng/mL。80 μL血漿加入240 μL甲醇-乙腈=2∶1(V/V)[含0.01 mol/L 2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)]渦旋混勻,超聲振蕩5 min,-20 ℃靜置30 min,10 000 r/min離心15 min,取上清240 μL,揮干,加入200 μL甲醇-水=2∶98(V/V)渦旋混勻,超聲1 min,加入200 μL氯仿4 ℃靜置10 min,10 000 r/min離心5 min,取上清160 μL進樣。

1.6 UPLC-ESI-MS/MS靶向檢測TMAO系列代謝物的條件與數據分析

采用電噴霧離子源,正離子掃描,多反應檢測(MRM)模式進行分析,優化正離子模式優化去簇電壓(DP)、碰撞電壓(CE)、碰撞室射出電壓(CXP)等質譜參數(見表1),質譜分析條件:氣簾氣35;離子噴霧電壓5 500 V;溫度 550 ℃;離子源Gas 1∶35;Gas 2∶30。色譜流動相A(0.1%甲酸-水溶液),流動相B(乙腈),流速0.3 mL/min;梯度洗脫程序見表2。利用Analyst軟件,采用默認參數對各MRM transition進行自動識別和積分,以質譜峰面積為縱坐標、物質濃度為橫坐標繪制線性回歸標準曲線。將樣品分析物的質譜峰面積代入線性方程中,計算濃度。

表1 質譜參數

表2 梯度洗脫程序

1.7 免疫組化觀察主動脈CD36、NLRP3的表達與分布

小鼠胸主動脈切片脫蠟至水,枸櫞酸鹽緩沖液微波爐高火加熱進行抗原修復。然后滴加 3% H2O2室溫孵育10 min,山羊血清室溫封閉 30 min,分別滴加兔抗小鼠 CD36、NLRP3一抗(1∶200 稀釋)4 ℃孵育過夜,磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照,次日依次滴加羊抗兔IgG二抗、SABC,DAB顯色,蘇木素復染3 min,顯微鏡下觀察棕黃色顆粒沉積作為陽性。隨機選取5個視野,以Image J軟件進行半定量分析。

1.8 ELISA檢測血漿IL-1β、IL-18含量

依據ELISA試劑盒說明書操作,檢測血漿IL-1β、IL-18含量。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 主動脈形態

各組小鼠胸主動脈HE染色顯示,C57正常對照組主動脈細胞排列有序,管壁光滑,內-中膜厚度適中;ApoE-/-模型組主動脈平滑肌層細胞排列紊亂,細胞核濃染,內-中膜間可見脂質沉積導致的空泡和組織異常,細胞外基質中可見大量膠原沉積;應用半夏白術天麻湯和瑞舒伐他汀鈣后,脂質空泡顯著減少,膠原沉積減輕,血管結構、形態有明顯的改善。詳見圖1。

圖1 小鼠胸主動脈HE及Masson染色切片圖

2.2 血漿TMAO及相關代謝物水平的靶向UPLC-ESI-MS/MS檢測

ApoE-/-模型組血漿左旋肉堿、甜菜堿、肌酐、三甲胺、TMAO水平高于C57正常對照組(P<0.05或P<0.01);半夏白術天麻湯和瑞舒伐他汀鈣干預后,均能降低左旋肉堿、甜菜堿、肌酐、三甲胺、TMAO水平,與ApoE-/-模型組比較差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01);但半夏白術天麻湯組血漿膽堿水平高于ApoE-/-模型組及瑞舒伐他汀鈣組(P<0.01)。詳見圖2、表3。

圖2 各組UPLC-ESI-MS/MS血漿TMAO及相關代謝物水平比較

表3 各組血漿TMAO及相關代謝物水平比較(±s) 單位:ng/mL

2.3 主動脈CD36、NLRP3的分布

ApoE-/-模型組主動脈的CD36、NLRP3分布多于C57正常對照組主動脈(P<0.01);與ApoE模型組比較,半夏白術天麻湯組和瑞舒伐他汀鈣組主動脈的CD36、NLRP3分布降低(P<0.01),半夏白術天麻湯組和瑞舒伐他汀鈣組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見圖3、圖4。

圖3 免疫組化觀察小鼠主動脈CD36、NLRP3的切片圖

圖4 免疫組化觀察小鼠主動脈CD36、NLRP3分布柱狀圖

2.4 血漿IL-1β、IL-18含量

ApoE-/-模型組血漿IL-1β、IL-18高于C57正常對照組(P<0.01);與ApoE-/-模型組比較,半夏白術天麻湯組和瑞舒伐他汀鈣組血漿IL-1β、IL-18濃度降低(P<0.01),半夏白術天麻湯組和瑞舒伐他汀鈣組比較差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表4。

表4 各組血漿IL-1β、IL-18含量比較(±s) 單位:ng/L

3 討 論

半夏白術天麻湯是專于化痰濕、息內風的經典方藥[9],源于李東垣的《脾胃論》,經清代名醫程國彭加減形成現在的組方形式。據納入112 458例眩暈病人、隨訪15年的真實世界研究發現,半夏白術天麻湯不僅緩解了眩暈的臨床癥狀,還有效降低了眩暈病人的卒中風險,其藥效優于苓桂術甘湯和天麻鉤藤飲[10]。據納入1 424例高血壓病人的Meta分析證實,半夏白術天麻湯可有效降低收縮壓,半夏白術天麻湯聯合西藥的降壓藥效明顯優于單獨西藥治療,使病人得到更大獲益[11]。另據納入2 796例椎-基底動脈供血不足病人的Meta分析,半夏白術天麻湯提高了左椎動脈、右椎動脈、基底動脈的血流速度,減少了短暫性腦缺血(TIA)發作次數[12]。雖以上研究均未對其藥理機制進行闡釋,但通過分析半夏白術天麻湯的臨床適應證,提示半夏白術天麻湯可改善動脈粥樣硬化這一共同致病因素,從而實現其治療高血壓、眩暈、TIA,降低腦卒中風險的藥效,因此,對半夏白術天麻湯藥理機制的探索具有重要的臨床意義。本課題組既往研究證實,半夏白術天麻湯可有效改善氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導的血管內皮功能紊亂[6],降低多種循環脂質水平,并減少脂質沉積于大動脈[7]。半夏白術天麻湯健脾祛濕,尤擅治療代謝相關的心腦血管疾病,但其調節代謝的機制和靶標仍亟待深入研究。

TMAO是獨立于傳統心血管危險因素及心腎功能的新型代謝小分子指標,TMAO水平不僅與動脈粥樣硬化風險呈正相關,而且與腦鈉肽水平也具有相關性,高TMAO水平提示心因性死亡風險增加[13]。因肉堿、甜菜堿、膽堿均是TMAO的前體物質,在腸道菌群作用下轉化為三甲胺,繼而在肝臟黃素單加氧酶(FMOs)的作用下可轉化為TMAO,血漿中的膽堿、甜菜堿、左旋肉堿升高預示著不良心血管事件的風險增加[14]。本研究中,半夏白術天麻湯降低了ApoE-/-小鼠血漿左旋肉堿、甜菜堿、肌酐、三甲胺、TMAO水平,顯示出強大的改善動脈粥樣硬化相關代謝物的作用。令人意外的結果是,半夏白術天麻湯組血漿膽堿水平高于其他3組,膽堿作為磷脂的組分,是生物膜的重要組成成分,也是迷走神經遞質乙酰膽堿的前體分子[15],提示半夏白術天麻湯以更為復雜的方式調節膽堿水平,參與心血管疾病過程。

TMAO是CD36和NLRP3的內源性配體[16]。巨噬細胞通過CD36介導的內吞途徑,促進可溶性ox-LDL的攝取,導致溶酶體破裂和NLRP3炎癥小體的活化[17]。NLRP3炎癥小體廣泛存在于單核-巨噬細胞中,TMAO激活NLRP3炎癥小體后,導致單核-巨噬細胞集聚活化,促進IL-1β、IL-18的成熟和釋放,在非感染情況下引發和維持慢性炎癥反應,參與心血管炎癥過程及動脈粥樣硬化的發生發展,增加心腦血管事件風險。在本研究中,應用半夏白術天麻湯后,ApoE-/-小鼠在主動脈CD36、NLRP3分布減少的同時,IL-1β、IL-18水平也隨之降低,提示機體炎癥水平的下調。

本研究證實,半夏白術天麻湯調節TMAO代謝途徑,減少膽固醇蓄積、泡沫細胞形成和血管炎癥,從而改善ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化。已知腸道菌群是肉堿、甜菜堿、膽堿轉化為TMAO的關鍵因素,提示半夏白術天麻湯與腸道菌群的關系也是今后的研究方向。