三葉糖脂清片調(diào)控載脂蛋白A5干預(yù)脂代謝的實驗研究

路美娟,趙英強(qiáng),李曉函,孫立倩

脂質(zhì)代謝紊亂又稱高脂血癥,是動脈粥樣硬化的主要危險因素之一,與冠心病、腦血管病的發(fā)病直接關(guān)聯(lián)[1]。動脈粥樣硬化的形成與三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)等密切相關(guān)。隨著飲食結(jié)構(gòu)的變化,全球高脂血癥發(fā)病率逐年升高,高三酰甘油血癥在中青年人群中發(fā)病率尤為突出,TG在動脈粥樣硬化(AS)發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用及其機(jī)制越來越受到重視,研究證實,TG是通過促使血管內(nèi)皮功能失調(diào)、促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成、誘發(fā)炎癥反應(yīng)等方面促進(jìn)動脈粥樣硬化形成[2-3]。目前,臨床中降低TG主要依靠貝特類藥物,但長期服用存在橫紋肌溶解等副作用[4]。中藥治療高三酰甘油血癥具有安全有效、副作用小等優(yōu)點。載脂蛋白A5(ApoA5)已被證明是一個關(guān)鍵性的血漿TG調(diào)節(jié)因子[5-6],目前中藥調(diào)控ApoA5影響脂質(zhì)代謝的機(jī)制研究較少。

三葉糖脂清片源自宋代《太平圣惠方》,是天津中醫(yī)藥大學(xué)張伯禮教授臨床經(jīng)驗方,由山楂、桑葉、荷葉、赤芍、丹參5味中藥組成,其中,首選健胃消食、消散瘀血的山楂為君藥,山楂化瘀血而不傷新血,開郁氣而不傷正氣,配以桑葉宣發(fā)肺氣,丹參化濕降濁行氣,荷葉活血消導(dǎo),赤芍清熱散瘀;五味藥配伍體現(xiàn)了升清降濁之法,具有健脾除濕、利水祛痰、活血逐瘀的功效。

藥效學(xué)研究表明,三葉糖脂清能夠降低TC、TG、LDL-C,調(diào)節(jié)血脂,減輕肝臟脂肪變性[7]。三葉糖脂清片改善糖脂代謝機(jī)制不明,是否通過調(diào)控ApoA5基因表達(dá),進(jìn)而激動過氧化物酶體增生物活化受體(PPARs),上調(diào)ApoA5基因,進(jìn)而激活脂蛋白脂酶(LPL)促進(jìn)富含TG的脂蛋白微粒(TRL)脂解需要進(jìn)一步研究。因此,本研究旨在探討三葉糖脂清片降脂作用機(jī)制是否與調(diào)控ApoA5表達(dá)相關(guān),驗證通過上調(diào)激動PPARs,上調(diào)ApoA5,進(jìn)而激活LPL,促進(jìn)TRL脂解的作用機(jī)制是否成立,為將來中藥調(diào)控ApoA5降脂作用機(jī)制研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥品

三葉糖脂清片水提物過濾干燥備用,出膏率8.8%,由天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院藥學(xué)部提供,實驗前用0.5%羥甲基纖維素鈉(CMC)配制成0.60、0.30、0.15 kg/L的藥液。血脂康膠囊由北京北大維信生物科技有限公司生產(chǎn)(批號:20060611),實驗前用0.5%CMC配制成25 g/L的藥液。非諾貝特片由迪沙藥業(yè)集團(tuán)有限公司生產(chǎn)(批號:H37022898)。

1.1.2 實驗動物

健康雄性小鼠90只,6～8周齡,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,溫度19～24 ℃,相對濕度為40%～70%。符合《中華人民共和國衛(wèi)生部實驗動物環(huán)境設(shè)施標(biāo)準(zhǔn)》。

1.1.3 試劑

普通飼料由天津市英博生化試劑有限公司負(fù)責(zé)提供。高脂飼料由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司負(fù)責(zé)提供。葡萄糖(GLU)、TG、TC、LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)試劑盒均由中生北控生物科技股份有限公司負(fù)責(zé)提供;小鼠ApoA5試劑盒由北京方程生物科技有限責(zé)任公司負(fù)責(zé)提供;酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)法檢測小鼠過氧化物酶體增生物活化受體α(PPARα)試劑盒、ELISA方法檢測小鼠LPL試劑盒均由北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司負(fù)責(zé)提供。

1.1.4 儀器

半自動生化分析儀(95版200型,荷蘭威圖);離心機(jī)(LD5-2A,北京醫(yī)用離心機(jī)廠生產(chǎn));精密電子天平(JA1003,上海天平儀器廠生產(chǎn))。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備脂代謝紊亂模型

模型建立選取雄性小鼠90只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按體質(zhì)量隨機(jī)區(qū)組法分為正常對照組和模型組,其中,正常對照組12只,模型組78只。正常對照組喂飼普通飼料,模型組飼喂高脂飼料,連續(xù)8周。8周后,禁食(不禁水)24 h,眼球后取穴,檢測血脂,以血清TC、TG、LDL-C含量明顯升高的小鼠為成功模型納入實驗。

1.2.2 飼料配方

高脂高膽固醇飼料,由南通特洛菲飼料科技有限公司提供,飼料代碼:TP26303。

1.2.3 分組及給藥方法

分組:保留正常對照組小鼠12只,選擇符合標(biāo)準(zhǔn)的模型組小鼠60只,采用隨機(jī)區(qū)組法分為模型組、非諾貝特組、血脂康組、三葉糖脂清片高劑量組及低劑量組,每組12只。給藥方法:非諾貝特組每日用藥劑量為0.1 g/kg;血脂康組每日用藥劑量為0.25 g/kg;三葉糖脂清片高劑量組、低劑量組每日用藥劑量分別為生藥6.0、1.5 g/kg。各組均灌胃給藥,給藥體積為1 mL/100 g,正常對照組和模型組給予等體積的0.5%羥甲基纖維素鈉,每周測量體質(zhì)量1次,根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整用藥劑量,連續(xù)30 d。用藥期間正常對照組給予普通飼料,模型組和各給藥組仍給予少量高脂飼料以維持模型,自由飲水。

1.2.4 取材

灌胃30 d后,禁食(不禁水)10 h,末次灌胃給藥1 h后,眼球后取血。將全血注入潔凈試管中靜置,3 500 r/min離心10 min,分離血清,分裝于1.5 mL凍存管中,-80 ℃冰箱冷藏待檢。取小鼠肝組織、心肌、主動脈根部,10%甲醛溶液固定待檢。取小鼠肝組織,分裝于凍存管內(nèi),-80 ℃冰箱冷藏待檢。

1.2.5 檢測方法

1.2.5.1 血清生化指標(biāo)檢測

應(yīng)用半自動生化分析儀(購買相應(yīng)試劑盒)采用終點法檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C、血糖含量。

1.2.5.2 血清ApoA5、PPARα、LPL蛋白檢測

采用ELISA法檢測血清ApoA5、PPARα、LPL蛋白表達(dá)水平。

1.2.5.3 肝臟組織ApoA5、PPARα、LPL的mRNA表達(dá)水平檢測

ApoA5、PPARα、LPL引物由上海生工生物公司提供。采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)方法,參照Invitrogen公司說明書,采用Trizol試劑提取肝臟總RNA,采用TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒(ABI,美國)和莖環(huán)RT引物將總RNA(0.2 μg)反轉(zhuǎn)錄為cDNA(10 μL體系)。0.5 μL的cDNA產(chǎn)物用作qRT-PCR擴(kuò)增的模板。PCR擴(kuò)增反應(yīng)采用SYBR Green PCR Master Mix reagentkits試劑盒(ABI,美國)和相應(yīng)特異引物,以三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR檢測,反應(yīng)參數(shù):95 ℃變性20 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,3步組成40個循環(huán)引物序列。引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.2.5.4 內(nèi)臟組織形態(tài)學(xué)觀察

取小鼠肝組織、心肌組織、主動脈根部,以10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,病理切片,蘇木素-伊紅(HE)染色后光鏡觀察,拍照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量比較(見表2)

表2 各組小鼠體質(zhì)量比較(±s) 單位:g

2.2 各組小鼠血脂水平比較

非諾貝特組、血脂康組及三葉糖脂清片高劑量組、低劑量組TC、LDL-C水平較模型組均降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);非諾貝特組、血脂康組、三葉糖脂清片高劑量組TG較模型組降低,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 各組小鼠血脂水平比較(±s) 單位:mmol/L

2.3 各組小鼠PPARα、ApoA5、LPL mRNA表達(dá)比較

模型組PPARα mRNA表達(dá)降低,非諾貝特組及三葉糖脂清片高劑量組PPARα mRNA表達(dá)量與模型組比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組ApoA5 mRNA表達(dá)明顯降低,非諾貝特組及三葉糖脂清片高劑量組ApoA5 mRNA與模型組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組LPL mRNA表達(dá)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),非諾貝特組、三葉糖脂清片高劑量組LPL mRNA表達(dá)較模型組有升高趨勢。詳見表4。

表4 各組小鼠PPARα、ApoA5、LPL mRNA表達(dá)量比較(±s)

2.4 各組小鼠PPARα、ApoA5、LPL含量表達(dá)比較

模型組、血脂康組、非諾貝特組及三葉糖脂清片低劑量組、高劑量組PPARα含量表達(dá)水平與正常對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。非諾貝特組、三葉糖脂清片低劑量組、三葉糖脂清片高劑量組、血脂康組LPL含量表達(dá)水平與模型組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。非諾貝特組、血脂康組、三葉糖脂清片高劑量組ApoA5含量表達(dá)較模型組升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);各治療組ApoA5含量達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。模型組、非諾貝特組及三葉糖脂清片低劑量組、高劑量組LPL含量表達(dá)與正常對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組小鼠PPARα、ApoA5、LPL含量表達(dá)比較(±s)

2.5 病理結(jié)果

正常對照組小鼠心肌細(xì)胞左心室前壁形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰完整,可分辨出瓣膜層、肌層和心內(nèi)膜層,心肌排列均勻,未見變性、梗死、纖維組織增生、炎細(xì)胞浸潤及血管增生等病變;模型組心肌細(xì)胞部分不規(guī)則,并可見水腫,以心內(nèi)膜下為著。治療后三葉糖脂清片高劑量組、低劑量組、血脂康組、非諾貝特組小鼠心肌細(xì)胞均顯示心肌排列均勻,未見變性、梗死、纖維組織增生、炎性細(xì)胞浸潤及血管增生等病變。表明對高脂血癥小鼠心肌細(xì)胞有保護(hù)作用。詳見圖1。

圖1 心肌細(xì)胞病理結(jié)果(×400)

正常對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)均清楚完整,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞為多邊形,排列成索狀,在中央靜脈周圍呈放射狀分布;肝細(xì)胞彌漫性腫脹,部分氣球樣變;未見脂肪變及炎癥改變。模型組肝臟組織肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝細(xì)胞腫大變圓,大量細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂滴,部分形成大空泡,將細(xì)胞核推擠至細(xì)胞一側(cè);肝細(xì)胞排列紊亂并伴大量肝細(xì)胞腫脹,部分呈氣球樣變;匯管區(qū)可見輕度炎癥。治療后三葉糖脂清片高劑量組、低劑量組、血脂康組、非諾貝特組小鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)均清楚完整,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細(xì)胞為多邊形,排列成索狀,在中央靜脈周圍呈放射狀分布;部分肝細(xì)胞輕度腫脹,未見脂肪變及炎癥改變。表明對高脂血癥小鼠肝臟組織有保護(hù)作用。詳見圖2。

圖2 肝臟組織病理結(jié)果(×400)

正常對照組主動脈管腔規(guī)則,表層內(nèi)皮連續(xù)完整,動脈壁厚度均勻,層次清晰,未見脂質(zhì)沉積及內(nèi)膜損傷。模型組動脈壁可見少量脂質(zhì)沉積。治療后三葉糖脂清片高劑量組、低劑量組、血脂康組、非諾貝特組小鼠主動脈管腔規(guī)則,表層內(nèi)皮連續(xù)完整,動脈壁厚度均勻,層次清晰,未見脂質(zhì)沉積及內(nèi)膜損傷,表明三者對高脂血癥小鼠主動脈脂質(zhì)沉積有抑制作用。詳見圖3。

圖3 主動脈病理結(jié)果(×400)

3 討 論

脂質(zhì)代謝紊亂是動脈粥樣硬化的主要危險因素,冠心病、腦血管疾病的發(fā)病均與動脈粥樣硬化直接關(guān)聯(lián),因此,改善脂質(zhì)代謝紊亂能有效預(yù)防及治療心腦血管疾病。中藥的降脂作用在近年來臨床及實驗研究中均得到證實,但中藥改善脂代謝紊亂的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。ApoA5是較新發(fā)現(xiàn)的TG調(diào)控基因[8-9],中藥的降脂作用機(jī)制是否與調(diào)控ApoA5基因表達(dá)有關(guān)是目前需要探討的。有研究表明,ApoA5基因表達(dá)與PPARα及LPL關(guān)系密切[10],因此,提出中藥降脂作用通過上調(diào)PPARα,激動ApoA5基因表達(dá),從而激活LPL,最終促進(jìn)TRL脂解。

大量實驗研究結(jié)果顯示,三葉糖脂清湯劑有調(diào)節(jié)血脂、血糖、清除肝內(nèi)脂肪沉積、改善血液流變學(xué)的作用[11]。本研究通過動物實驗的方法,驗證三葉糖脂清改善糖脂代謝的作用,并改善脂質(zhì)沉積,通過檢測血清及肝臟組織ApoA5、PPARα、LPL表達(dá),表明三葉糖脂清片組PPARα水平升高,改善糖脂代謝機(jī)制不明,是否通過對ApoA5基因表達(dá)調(diào)控,進(jìn)而激動PPARs,上調(diào)ApoA5基因,進(jìn)而激活LPL,起到促進(jìn)富含TG的脂蛋白脂解作用。本研究結(jié)果與研究假設(shè)部分一致,結(jié)果驗證了三葉糖脂清改善脂代謝的作用,并改善肝臟及主動脈血管、心肌細(xì)胞脂質(zhì)沉積,表明三葉糖脂清片組ApoA5水平升高,得出三葉糖脂清片降低TG的作用是通過調(diào)控ApoA5基因表達(dá)完成的;然而假想的PPARα-ApoA5-LPL通路沒有得到證實,原因可能是:1)灌藥時間較短,肝臟及血清內(nèi)蛋白表達(dá)不明顯;2)可能有其他調(diào)控ApoA5通路,三葉糖脂清改善脂代謝作用不是通過PPARα-ApoA5-LPL完成的。

本研究為中藥通過影響ApoA5基因表達(dá)從而起降脂作用的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ),為將來大規(guī)模中醫(yī)藥對ApoA5基因表達(dá)影響的作用研究及與其相關(guān)動脈粥樣硬化性疾病的臨床及實驗研究提供了基礎(chǔ)。