急性缺氧誘導小鼠心肌細胞微小RNA-34a升高和凋亡實驗研究

劉龍梅,石懿玉,楊 霞,介 希,連婷婷,王仲朝,韓學斌

(山西省心血管病醫院/研究所 山西醫科大學附屬心血管病醫院,山西 太原 030024)

急性心肌梗死(Acute myocardial infarction,AMI)是臨床常見的危急重癥疾病,是由急性持續性冠狀動脈缺血、缺氧造成部分心肌急性壞死引起的嚴重冠心病,其基本特征表現為起病急、進展快、預后差,目前已經成為引起我國居民死亡的最主要疾病之一[1]。盡早恢復急性心肌梗死患者正常血供可使心肌缺血減輕,但可能導致再灌注損傷,加快心肌細胞壞死,嚴重者可發生惡性心律失常甚至死亡,因此治療急性心肌梗死時要重視心臟保護[2]。通過心肌修復,對抗心肌凋亡,對于AMI治療有積極的意義。Li等[3]發現,miRNA-34a在心臟中高度表達,miRNA-34a通過對相關靶基因的表達調控,參與多種病理生理過程,與血管損傷和細胞凋亡均有密切的關系[4]。之前有研究表明[5-6],微小RNA-34a(microRNA-34a,miR-34a)參與AMI后心肌修復,RNA納米技術在心肌修復靶向治療中的應用報道較少。本實驗選取含有antimiR-34a的納米顆粒(Nanoparticles,NP)干預缺氧24 h后的原代小鼠心肌細胞,觀察其在急性缺氧小鼠心肌細胞心肌修復中的作用與影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 C57BL/6J小鼠購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。胎牛血清購自美國Gibco公司。PNUTS、GAPDH抗體購自美國Abcam公司。antimiR-34a納米顆粒購自美國Nanobio Delivery Pharmaceutical有限公司。miScript SYBR Green試劑盒購自德國QIAGEN公司。Western blot試劑、流式細胞測試試劑盒購自山西賽奧生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠乳鼠心肌細胞原代培養與鑒定:C57BL/6J雌雄小鼠自然繁殖,取2～4 d齡小鼠乳鼠,75%乙醇消毒,剪開胸部迅速取出心臟,預冷D-Hanks液中將心室剪成1 mm3碎片,加5 ml消化液,室溫靜置5 min后棄上清,再加5 ml消化液,室溫靜置20 min后,將未完全消化的心臟碎片吸到另一個無菌離心管中,加入2 ml預冷培養液終止消化,1000 r/min離心5 min后棄上清,沉淀中加入D-Hanks液3 ml,1500 r/min離心10 min后棄上清,沉淀物加培養液2 ml,用吸管吹打成懸液,吸到細胞培養瓶內,37 ℃、5%CO2孵箱培養[7]。將培養成熟的心肌細胞接種于玻底培養皿中,固定液12 min,PBS清洗,0.2%Triton X-100室溫通透 5 min,PBS清洗。5%羊血清室溫封閉2 h,加1∶100稀釋好的rat anti-mouse α-actin antibody,封膜4 ℃過夜。第2天PBS清洗,加1∶200稀釋好的goat anti-rat IgG二抗,37 ℃避光孵育1 h。棄去后加PBS清洗3次,每次10 min,加DAPI,封片,熒光顯微鏡下拍照、計數,計算純度。

1.2.2 實驗分組:采用隨機數表將其分為三組:對照組(Control組,C組)、急性缺氧組(Ischemia組,I組)、急性缺氧+antimiR-34a納米顆粒組(Ischemia+antimiR-34a NP組,I+NP組)。缺氧使用厭氧包與細胞一起孵育。于缺氧前60 min在培養液中加入antimiR-34a納米顆粒。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)測miR-34a的表達:使用無RNA酶的槍頭和離心管,Trizol法抽提總RNA,使用Nanodrop 2000檢測RNA濃度及純度,將終濃度定為100 ng/μl。反應體系為:miScriptHispct(5×)4 μl,miScriptNucleics(10×)2 μl,miScript Reverse Transcriptase 2 μl,RNA 模板12 μl。逆轉錄條件:37 ℃ 60 min,95 ℃ 10 min。最后加入80 μl ddH2O水稀釋。按照試劑盒進行qPCR反應,反應體系10 μl:預加熱95 ℃ 30 min,變性94 ℃ 15 s,退火55 ℃ 30 s,延伸70 ℃30 s,共40個循環。Ct值為反應孔的熒光信號達到設定閾值的循環數。采用U6作為內參,miR-34a相對表達量為2-ΔΔCt=CtmiR-34a-CtU6。miR-34a引物5’-TGACTGGCAGTGTCTTAGCT-3’,內參U6引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,重復3次。

1.2.4 Western blot檢測PNUTS蛋白的表達:使用RIPA提取液,加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑,4 ℃勻漿,取上清,BSA法定量,8% SDS-PAGE電泳后轉膜,5%脫脂奶粉封閉1 h,加一抗anti-PNUTS抗體和內參anti-GAPDH抗體4 ℃搖床過夜,1×TBST洗膜3次后加入二抗,再次1×TBST洗膜3次后,ECL發光,凝膠成像系統曝光,Image J分析條帶灰度值。

1.2.5 流式細胞術測凋亡:消化離心收集細胞至離心管中,PBS洗2遍,每管加入500 μl 1×Binding Buffer重懸細胞,每管加入5 μl Annexin V-FITC和10μl PI染料,混勻,室溫避光孵育5 min,過膜,流式細胞儀檢測。

1.3 統計學方法 采用SPSS 21.0統計學軟件進行分析。計量資料采用“均數±標準差”表示,兩兩比較采用獨立樣本t檢驗,組間比較采用單因素方差分析;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠心肌細胞原代培養及其鑒定 通過細胞免疫熒光,加入α-actin一抗檢測原代心肌細胞,鏡下可見培養成熟的小鼠心肌細胞,純度在95%以上。通過3次重復實驗表明,缺氧組miR-34a表達增加,相比較差異有統計學意義(P<0.05)。加入了antimiR-34a納米顆粒后,抑制了細胞內miR-34a的表達,差異有統計學意義。見圖1。

圖1 小鼠心肌細胞miR-34a表達(細胞免疫熒光染色,×200)

2.2 小鼠心肌細胞miR-34a擴增倍數 對照組(C組)的miR-34a擴增倍數是(1.02±0.04)。與C組相比,急性缺氧組(I組)的miR-34a擴增倍數為(2.07±0.18)明顯增高,差異有統計學意義(P<0.05)。與I組相比,急性缺氧 + antimiR-34a納米顆粒組(I+NP組)的miR-34a擴增倍數為(1.44±0.11) 明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

注:與C組比較,*P<0.05;與I組比較,#P<0.05

2.3 小鼠心肌細胞PNUTS蛋白表達 經過24 h急性缺氧處理后,miR-34a下游蛋白PNUTS的表達降低,加入antimiR-34a納米顆粒后表達上升,比較差異有統計學意義(P<0.05),見圖3。

注:與C組比較,*P<0.05;與I組比較,#P<0.05

2.4 小鼠心肌細胞凋亡率比較 對照組(C組)的凋亡率是(0.05±0.00)。與C組比較,急性缺氧組(I組)的凋亡率為(0.17±0.01)明顯增高,差異有統計學意義(P<0.05)。與I組比較,急性缺氧+antimiR-34a納米顆粒組(I+NP組)的凋亡率為(0.10±0.05) 明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注:與C組相比,*P<0.05;與I組相比,#P<0.05

3 討 論

急性心肌梗死已經成為全球發生率和病死率最高的一類疾病[8]。盡管近年來該病治療方法和技術取得巨大進步,但缺血缺氧引起的心肌損傷仍然是造成患者死亡的重要原因。近來研究證實抑制miR-34a可以降低急性心肌梗死后所發生的細胞死亡和纖維化情況,促進心肌功能的恢復[9-10],過表達miR-34a可促進缺氧復氧和高血糖狀態下心肌細胞株H9C2 凋亡[11-12],提示miR-34a在促心肌細胞凋亡中發揮重要調控作用。缺氧參與心肌細胞miR-34a的表達,以往研究多集中缺氧復氧后的研究,或者慢性長期缺氧方面,而關于早期缺氧的研究較少[5-6,13-16]。本研究通過觀察急性缺氧對原代小鼠心肌細胞miR-34a表達的影響,發現急性缺氧miR-34a基因表達明顯升高,其下游的蛋白磷酸酶1核靶向亞基(PNUTS)蛋白亦明顯升高,同時激活了細胞凋亡;通過加入antimiR-34a納米顆粒干預,可以有效進入心肌細胞,減輕急性缺氧引起miR-34a基因升高、PNUTS蛋白升高及細胞凋亡。

有研究發現,缺氧復氧導致大鼠H9C2心肌細胞miR-34a表達下調,通過miR-34a激動劑才可以增加其表達[13-14]。這與本實驗的觀察正好相反,可能與細胞來源不同、復氧抵抗miR-34a有關。通過文獻我們反向推斷得出,急性缺氧是可以導致miR-34a升高的。本實驗通過培養原代小鼠心肌細胞做qRT-PCR測miR-34a證實了這樣的推論。其中,與對照組miR-34a的表達倍數(1.02±0.04)比較,急性缺氧組(2.08±0.18)和急性缺氧+antimiR-34a納米顆粒組(1.44±0.11)均升高(均P<0.05)。同時發現antimiR-34a納米顆粒預干預并不能完全抵抗缺氧導致的miR-34a升高,且與急性缺氧組相比,急性缺氧+antimiR-34a納米顆粒組的這種抵抗比較差異有統計學意義(P<0.05)。結果提示,急性缺氧上調miR-34a基因的表達,antimiR-34a納米顆?？梢缘挚惯@種上調趨勢。我們推斷,這種含有antimiR-34a的納米顆粒,或可以進入心肌細胞影響細胞內環境,從而發揮與之前的文獻一致的效果[6]。

有研究人員找到了miR-34a的一種新型直接靶標PNUTS,能調低端?？s短,DNA損傷反應和心肌細胞凋亡,并且促進急性心肌梗死后的功能恢復[15]。在通過干擾PNUTS的同時,miR-34a亦會受到影響[16]。本實驗結果發現,與對照組的(1.12±0.05)比較,急性缺氧組的PNUTS /GAPDH灰度值比值為(0.31±0.03),提示PNUTS表達顯著降低。加入antimiR-34a納米顆粒后,PNUTS /GAPDH灰度值比值為(0.78±0.09),與急性缺氧組(0.31±0.03)比較差異有統計學意義(P<0.05)。PNUTS作為miR-34a的下游反饋基因呈負相關。antimiR-34a納米顆粒下調急性缺氧誘導的PNUTS降低。再次證實急性缺氧的確與miR-34a這一靶標高度相關,miR-34a可能成為急性缺氧期PNUTS發揮心肌修復作用的生物標志靶點[15-16]。

心肌細胞壞死和凋亡是心肌損傷的細胞學基礎[17]。細胞凋亡參與了冠心病、心肌病以及慢性心力衰竭等多種心血管疾病的病理生理進程,缺氧、機械應力、神經激素、炎癥、氧化應激等多種刺激因素引起或加劇心肌細胞凋亡[18]。急性缺氧可以誘導凋亡已獲得證實[19]。但是凋亡是否與miR-34a增高有關,是否與PNUTS增高有關,有待進一步研究。本實驗通過在急性缺氧條件下加入antimiR-34a納米顆粒后發現,antimiR-34a納米顆粒下調急性缺氧誘導的凋亡。其中,與對照組的凋亡率(0.05±0.00)相比,急性缺氧組的凋亡率升高至(0.17±0.01),提示急性缺氧可以導致心肌細胞凋亡的發生。加入antimiR-34a納米顆粒后,急性缺氧+antimiR-34a納米顆粒組的凋亡率降為(0.10±0.05),與急性缺氧組相比有所降低(P<0.05),提示antimiR-34a納米顆粒具有下調凋亡率的作用,抵抗急性缺氧后心肌凋亡的發生,保護心功能。同時,急性缺氧+antimiR-34a納米顆粒組的凋亡率與對照組的比較差異有統計學意義(P<0.05),提示急性缺氧深度參與了細胞凋亡的發生,而antimiR-34a納米顆粒不可完全逆轉這種凋亡損傷。

靶向干預心肌細胞凋亡可能是心血管疾病的潛在治療方式[20]。納米顆粒靶向治療的應用,是目前科研界新的探索。研究表明[6],antimiR-34a納米顆粒在動物體內具有較好的親和性。本次實驗發現,antimiR-34a納米顆?；蛞灿辛己玫男募〖毎邢蜃饔?能夠呈遞antimiR-34a進入心肌細胞,延緩心肌細胞凋亡,改善心功能。

綜上所述,急性缺氧上調小鼠心肌細胞miR-34a表達,上調下游PNUTS蛋白的表達和心肌細胞凋亡的發生;antimiR-34a納米顆粒可以進入心肌細胞抵抗急性缺氧引起上述損傷。但是,目前仍然需要更進一步的觀察和機制研究來評價antimiR-34a納米顆粒的安全性與有效性,為RNA納米技術在AMI靶向修復中提供更多科學依據。