槲皮素通過生長抑制特異性基因5調節微小RNA-23a-3p和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號通路抑制垂體神經內分泌腫瘤的增殖機制

李 杰,李 瑞,李虹良,陳康雪,孫中磊

(北京精誠博愛醫院神經二科,北京 100015)

垂體神經內分泌腫瘤(Pituitary neuroendocrine tumors,PitNETs)是一種常見的神經和內分泌系統腫瘤,約占顱內腫瘤的8%～15%。雖然手術切除是PitNETs的主要臨床治療方法,然而許多PitNETs患者仍存在腫瘤復發的風險[1]。因此,研究 PitNETs 異常生長的分子機制對于發現新的治療靶點和提高患者生存率具有重要意義。有研究表明,生長抑制特異性基因5 (Growth arrest-specific transcript 5,GAS5)在多種惡性腫瘤中表達下調,其過表達能夠抑制多種腫瘤細胞系的生長[2-4]。而最近的研究表明,GAS5可以通過微小RNA-23a-3p (miR-23a-3p) /磷酸酶和緊張素同系物(PTEN)/ 磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶 B(AKT)通路抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲[5],這可能是GAS5通過吸附微小RNA-23a(miR-23a)發揮作用的[6]。PI3K/AKT信號通路作為抑癌信號通路被證明可以促進垂體腫瘤細胞自噬而發揮抑癌作用[7]。槲皮素(Quercetin)作為一種天然小分子黃酮類化合物,在抗癌作用研究中取得了許多進展,已知信號通路包括分泌型糖蛋白/β-連環蛋白(Wnt/β-catenin)、磷脂酰肌醇3激酶/磷酸激酶B (PI3K/AKT)、Janus激酶/信號轉導子和轉錄激活子(JAK/STAT)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、細胞腫瘤抗原p53/核因子激活的B細胞的κ-輕鏈增強(p53/NFκB)通路,在預防腫瘤生長、增殖和進展中發揮重要的作用[8-9]。而最近的研究發現,槲皮素可以在乳腺癌細胞中促進GAS5的表達[10],槲皮素(Quercetin)能否在PitNETs中調節GAS5/miR-23a-3p水平仍未可知。因此,探究槲皮素在PitNETs調節GAS5/miR-23a-3p功能可能為PitNETs治療提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 主要材料 人垂體瘤細胞系RC-4B/C購自上海中科院細胞庫;DMEM培養基和其他細胞培養物品購自Gibco(北京)公司;槲皮素(貨號100081-201610)購自Sigma Aldrich公司;PI3K (ab97862)、磷酸化 PI3K(p-PI3K)(ab302958)、AKT (ab283852)、磷酸化 AKT(p-AKT)(ab8805)、膠質纖維酸性蛋白(GFAP)(ab4674)均購abcam公司;Magna RIP RNA 結合蛋白免疫沉淀試劑盒(貨號17-700)購自Millipore(上海)公司;Lipofectamine 2000轉染試劑(12566014)、RPMI 1640、Opti-MEM培養基購自Life Technologies上海公司;wt-GAS5、mut-GAS5、mimic NC、miR-23a-3p mimic、si-GAS5由上海賽默飛世爾科技公司合成,DIPI(19269-67-1) MTT、RIP 緩沖液、RT-qPCR引物、內參、Trizol及去RNA酶處理的物品購自上海賽默飛世爾科技公司,Tranwell小室、細胞培養板及計數板購自美國康寧公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 RC-4B/C細胞培養及轉染:選取 RC-4B/C 細胞,在37 ℃和含5% CO2的條件下用含10%胎牛血清、1% 100 U/L青/鏈霉素的DMEM 培養基進行常規培養。取對數生長期細胞鋪板在0.5 ml含血清,不含抗生素的正常培養基中。按照試劑說明書使用Lipofectamine 2000試劑分別轉染wt-GAS5、mut-GAS5、mimic NC、miR-23a-3p mimic、si-GAS5入RC-4B/C細胞,48 h后檢測報告基因活性。免疫熒光觀察RC-4B/C 細胞形態及數目,綠色GFAP,藍色DIPI。試驗分組:對照組(Control)、槲皮素組(Quercetin)、GAS5抑制組(Si-GAS5)和槲皮素+si-GAS5組(Quercetin+si-GAS5)組。

1.2.2 RT-qPCR檢測RC-4B/C細胞中miR-23a-3p與GAS5 miRNA表達水平:RC-4B/C細胞在轉染 48 h后,采用 Trizol 法提取細胞總RNA。將總 RNA(1 μg)逆轉錄為 miRNA 反應所需的 cDNA,反應程序為 37 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min。將細胞總 RNA(1 μg)反轉錄為 cDNA,反應程序為兩步法:第 1 步 65 ℃ 5 min;第 2 步 42 ℃ 60 min,85 ℃ 5 min。miRNA反應以通用引物為上游引物及 All-in-OneTM miRNA qPCR primer 為實時定量miRNA 特異引物,使用 SYBR 法擴增 miR-23a-3p片段,以 U6 作為內參。GAS5 miRNA 反應以 GAPDH miRNA作為內參。反應條件為:95 ℃變性 10 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸 15 s,重復 40個循環。Ct 值根據2-ΔΔCt算法處理得到基因的相對表達量,結果以(平均值±標準差)表示。基因及引物序列見表 1。

表1 實時PCR中使用的引物序列

1.2.3 MTT檢測RC-4B/C細胞活性:采用MTT法檢測RC-4B/C細胞活性,取對數生長期的各組細胞計數(2×105個/ml)后接種于96孔板,每孔50 μl,每組設置3個復孔。培養12 h后,每孔加MTT溶液20 μl,繼續孵育4 h,加150 μl DMSO,終止反應,490 nm波長下測定各實驗孔OD值,連續記錄48 h,繪制細胞生長曲線。

1.2.4 Transwell小室檢測RC-4B/C細胞侵襲能力:取重懸各組細胞(1×104/ml)200 μl加入Transwell小室中,置于實驗孔中培養24 h;取出Transwell小室,去除小室薄膜上層細胞,結晶紫染色薄膜下層細胞后,置于顯微鏡下計數拍照。

1.2.5 雙熒光素酶報告實驗驗證miR-23a-3p與 GAS5特意結合:將含有與miR-23a-3p 結合位點的野生型 (WT) 或突變型lncRNA GAS5 分別克隆到pmirGLO 熒光素酶載體 (Promega,Madison,WI,USA) 中。使用 Lipofectamine 2000 將 24 孔板上的細胞與野生型或突變質粒和 miR-23a-3p mimic或 mimic NC共轉染。使用雙熒光素酶報告分析系統測量熒光素酶活性。

1.2.6 RNA免疫沉淀(RIP)驗證miR-23a-3p與 GAS5特意結合:按照試劑說明使用 Magna RIP RNA 結合蛋白免疫沉淀試劑盒檢測。采用生長到70%～80% 匯合度的 PitNET 細胞并在 RIP 緩沖液中裂解。將細胞裂解物與抗 Ago2(Sigma Aldrich,MO,USA)或與瓊脂糖珠結合的抗 IgG 抗體共免疫沉淀。最后,純化共沉淀的 RNA 并用于 qRT-PCR 分析。

1.2.7 Western blot檢測RC-4B/C細胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平:轉染后,收獲細胞并在放射免疫沉淀測定裂解緩沖液中在 4 ℃下裂解 30 min。使用BCA 蛋白質測定試劑盒對蛋白質濃度進行定量。蛋白質樣品在 10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離,并轉移到聚偏二氟乙烯膜。在室溫下用 5%脫脂牛奶封閉 1 h后,在 4 ℃[PI3K1∶1000稀釋;磷酸化PI3K(p-PI3 K) 1∶2000 稀釋; AKT 1∶2000稀釋;磷酸化 AKT(p-AKT)1∶2000稀釋]。然后將膜洗滌并與二抗(1∶2000稀釋)在室溫下孵育1 h。然后,將化學發光試劑均勻加入膜中,用顯影液顯影。在實驗期間對所有蛋白質印跡進行相對光密度分析。

2 結 果

2.1 GAS5與miR-23a-3p直接結合 經過生物信息學網站Starbase 數據庫(https://starbase.sysu.edu.cn/)預測,miR-23a-3p作為保守序列與lncRNA GAS5競爭性結合,作用位點見圖1A。雙熒光素酶報告實驗檢測結果表明,miR-23a-3p mimic組顯著降低了wt-GAS5 載體的熒光素酶活性[(0.46±0.08)與(1.04±0.05)](t=15.06,P=0.001),但未能改變 mut-GAS5 載體的熒光素酶活性[(1.12±0.14)與(1.11±0.15)](t=0.119,P=0.907,見圖 1B)。RIP檢測顯示 lncRNA GAS5 和 miR-23a-3p 在Ago2顆粒有明顯統計學差異[(189.3±25.8)與(268.4±31.6)](t=4.750,P=0.001),在anti-IgG顆粒無統計學差異(P>0.05),見圖1B。

注:A圖為使用 RegRNA 網站分析 GAS5 和 miR-23a-3p 之間的相互作用位點;B圖為通過熒光素酶報告基因測定檢查lncRNA GAS5和miR-23a-3p之間的相互作用活性;C圖為RIP檢測證實了lncRNA GAS5和miR-23a-3p在RC-4B/C細胞中的相互作用。與miR-23a-3p mimic比較,*P <0.05

2.2 槲皮素促進 GAS5的表達水平比較 與對照組相比,Quercetin組GAS5表達水平明顯增加[(1.59±0.08)與(1.01±0.05)],抑制GAS5組GAS5表達水平明顯減少[(0.15±0.03)與(1.01±0.05)],槲皮素可以逆轉GAS5抑制,增加GAS5的表達水平[(0.76±0.04)與(0.15±0.03)],相比較差異具有統計學意義(均P<0.05)。見圖2。

注: 與Control組比較,*P<0.05,**P<0.01;與si-GAS5組比較,#P<0.05

2.3 槲皮素抑制miR-23a-3p和PI3K/AKT的表達水平比較 與對照組相比,Quercetin組miR-23a-3p表達水平明顯下降[(0.35±0.04)與(1.01±0.05)],PI3K[(0.75±0.10)與(1.21±0.09)]和AKT[(0.55±0.05)與(0.65±0.08)]的磷酸化水平明顯下降,si-GAS5組miR-23a-3p表達水平明顯下降[(1.65±0.08)與(1.01±0.05)],PI3K[(1.45±0.12)與(1.21±0.09)]和 AKT [(0.86±0.06)與(0.65±0.08)]的磷酸化水平明顯升高,差異具有統計學意義(均P<0.05);而Quercetin+si-GAS5組miR-23a-3p表達水平較si-GAS5組明顯下降[(1.24±0.05)與(1.65±0.08)],PI3K[(0.89±0.11)與(1.45±0.12)]和AKT[(0.71±0.05)與(0.86±0.06)]的磷酸化水平明顯下降,差異具有統計學意義(均P<0.05)。見圖3。

注:A圖為miR-23a-3p的表達情況;B圖為PI3K/AKT及其蛋白磷酸化免疫印跡條帶;C圖為p-PI3K較PI3K表達情況; D圖為p-AKT較AKT表達情況。與Control組比較,*P <0.05,**P <0.01;與si-GAS5組比較,#P <0.05

2.4 槲皮素抑制RC-4B/C細胞增殖和侵襲 實驗72 h MTT實驗結果顯示,與對照組細胞相比,Quercetin組細胞增值率[(0.192±0.025)與(0.261±0.017)]和細胞數[(46.3±4.6)與(72.5±6.3)]明顯降低,si-GAS5組細胞增值率[(0.295±0.031)與(0.261±0.017)]和細胞數[(156.3±12.4)與(72.5±6.3)]明顯增加,差異具有統計學意義(均P<0.05);而Quercetin+si-GAS5組細胞增值率和細胞數較si-GAS5組明顯降低[(0.275±0.018)與(0.295±0.031)]、[(91.5±11.6)與(156.3±12.4)],差異具有統計學意義(均P<0.05),見圖4A。PI3K/AKT及其蛋白磷酸化免疫印跡條帶見圖4B。結果顯示,與對照組細胞相比,Quercetin組穿膜細胞數[(59.3±5.8)與(96.1±7.2)]明顯降低,si-GAS5組穿膜細胞數[(265.3±14.6)與(96.1±7.2)]明顯增加,差異具有統計學意義(均P<0.05);而Quercetin+si-GAS5組穿膜細胞數較si-GAS5組明顯降低[(78.3±9.6)與(265.3±14.6)],差異具有統計學意義(P<0.05),見圖4C。

注:A圖為RC-4B/C細胞MTT試驗;B圖為RC-4B/C細胞免疫熒光染色(×200);C圖為RC-4B/C細胞Transwell試驗。與Control組比較,*P<0.05;與si-GAS5組比較,#P<0.05

3 討 論

大量研究報道lncRNAs在腫瘤的發生和發展過程中發揮著極其重要的作用。 lncRNAs不僅作為促進腫瘤形成的原癌基因,而且作為抑制腫瘤細胞增殖和遷移的抑癌基因。lncRNA GAS5的下調發生在多種癌癥中,包括乳腺癌、結直腸癌、胃癌、膠質瘤、骨肉瘤等[11-13]。有研究表明lncRNA GAS5過表達可以通過結合miRNA,調節miRNA的釋放抑制多種腫瘤的進展,包括在乳腺癌中結合miR-23a 促進腫瘤的自噬[6],在結腸癌中結合miR-182-5p抑制結腸癌細胞的增殖并促進細胞凋亡[14],在胃癌中結合miR-222通過PTEN/Akt/mTOR 信號傳導調節 GC 細胞增殖[15],在神經膠質瘤細胞中通過直接靶向結合 miR-222抑制細胞增殖、遷移和侵襲,發揮抗腫瘤作用[16]。以上研究表明,GAS5/miRNAs可能在多種腫瘤的預后治療中發揮作用,但GAS5/miRNAs在PitNETs中的表達和功能的研究報道較少。有研究表明lncRNA GAS5通過miR-23a-3p/PTEN/PI3K/AKT通路抑制骨肉瘤細胞的增殖和侵襲[5]。而PI3K/AKT信號通路在垂體腫瘤自噬中發揮作用[7]。lncRNA GAS5/miR-23a-3p能否在PitNETs中發揮作用的報道仍較少,為此我們展開相關研究。

lncRNA 的作用機制非常復雜,其中內源競爭RNA 是lncRNA在細胞質中最常見的作用方式。 lncRNAs攜帶某些 miRNAs 的種子序列,這些 miRNAs內源競爭吸附miRNAs,并阻止 miRNAs 與靶基因結合[17-18]。本研究首先通過starbase數據網站預測miR-23a-3p與GAS5基因的保守結合位點。為了進一步驗證GAS5與miR-23a-3p在PitNET細胞的關系,本研究采用雙熒光素酶報告基因實驗,結果顯示miR-23a-3p mimic顯著降低了wt-GAS5載體的熒光素酶活性,但未能改變mut-GAS5載體的熒光素酶活性,提示GAS5可能通過調控miR-23a-3p的表達釋放發揮調控作用。還有研究報道,在PitNETs的腫瘤發生和進展過程中,lncRNAs內源競爭吸附miRNAs[19]。lncRNA CLRN1-AS1內源競爭吸附miR-217以促進dickkopf WNT信號通路抑制劑1(DKK1)并調節垂體催乳素瘤的細胞活性[20]。還有許多研究證實miRNA在PitNETs腫瘤發生和進展中起著作用[21]。miR-27a-5p顯示在前列腺組織中顯著下調,伴隨異常的啟動子甲基化,而其在PC3細胞中的過表達抑制細胞生長,表明miR-27a-5p具有腫瘤抑制作用[22]。本研究的結果提供證據,證明通過RIP檢測顯示lncRNA GAS5和miR-23a-3p在Ago2顆粒比較有明顯差異,在anti-IgG顆粒比較沒有差異,進一步證明在PitNET細胞中miR-27a-5p 是lncRNA GAS5的直接下游靶標。在此,lncRNA GAS5在 PitNET細胞中的過表達降低了miR27a-5p的表達,從而抑制了增殖,導致PitNET細胞的G0/G1期細胞周期停滯和凋亡。

而槲皮素作為一種黃酮類化合物,在腫瘤學中具有很高的潛力。槲皮素的抗癌作用依賴于其通過調節細胞周期蛋白、促凋亡、PI3K/Akt和MAPK分子途徑來減少增殖、誘導細胞凋亡、導致細胞周期停滯和抑制有絲分裂過程的能力。有研究表明40 μmol/L的槲皮素可以明顯增加GAS5的表達[23]。在本研究中,40 μmol/L的槲皮干預組較對照組可以明顯抑制RC-4B/C細胞的增殖和侵襲,促進GAS5的表達,抑制miR-23a-3p表達水平。當si-GAS5轉染入RC-4B/C細胞后,與正常對照組和陰性對照組相比,GAS5的表達水平降低,miR-23a-3p表達水平升高,RC-4B/C細胞的增殖和侵襲增加。而再加入40 μmol/L的槲皮素后,可以逆轉si-GAS5對GAS5的沉默作用,提高GAS5的表達,抑制miR-23a-3p表達,抑制RC-4B/C細胞的增殖和侵襲。上述研究結果在一定程度上說明槲皮素可能通過GAS5/miR-23a-3p調控RC-4B/C細胞的增殖和侵襲。本研究的不足之處是缺乏臨床試驗,僅從理論分析和細胞實驗得出結論,而且關于GAS5/miR-23a-3p作用于PitNETs的研究較少,因此未來仍然需要進一步研究證實。

綜上所述,槲皮素可以抑制PitNETs細胞系RC-4B/C的增殖和侵襲,可能是通過促進GAS5表達抑制miR-23a-3p及PI3K/AKT信號通路的作用,沉默GAS5可促進RC-4B/C細胞的增殖和侵襲,而槲皮素的干預可以逆轉沉默GAS5的作用。其可能的機制是槲皮素通過靶向GAS5/miR-23a-3p抑制PitNETs細胞增殖和侵襲,GAS5/miR-23a-3p可能是潛在的治療靶點,該結果為PitNETs的臨床診療提供了新的方向。