載脂蛋白AⅡ基因-265T/C多態性與冠心病患者脂類代謝及冠脈狹窄程度相關性研究

金銀浩,劉桂清

(1.錦州醫科大學齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院研究生培養基地,黑龍江 齊齊哈爾161041;2.齊齊哈爾醫學院附屬第一醫院,黑龍江 齊齊哈爾161041)

冠心病(Coronary heart disease,CHD)屬于心血管內科較為常見的一種疾病,主要是指因冠狀動脈粥樣硬化病變引起血管腔狹窄或阻塞,繼而導致的一組以心肌缺血、缺氧和壞死為主要表現的心臟病[1]。隨著近年來高通量測序水平的飛速發展,加之對ApoAⅡ編碼基因的表達調控及多態性研究的日益深入,有學者發現ApoAⅡ-265T/C基因位點的多態性具有潛在抗動脈粥樣硬化作用,然而該基因對機體脂類代謝的具體調控作用以及和冠狀動脈狹窄程度的相關性尚未徹底闡明[2]。鑒于此,本文通過研究ApoAⅡ-265T/C多態性與CHD患者脂類代謝及冠脈狹窄程度相關性,以期為CHD的診治提供新的靶點,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇醫院從2022年4月至10月收治的96例CHD患者,記作研究組。其中男50例,女46例,年齡42～80歲,平均(62.35±10.32)歲;體重55～92 kg,平均(70.32±8.54)kg。另取同期健康體檢者100例作為對照組。其中男52例,女48例,年齡40～80歲,平均(61.85±9.85)歲,平均(10.25±3.21)歲;體重53～94 kg,平均(70.50±8.86)kg。各組上述一般資料無統計學差異(均P>0.05),具有可比性。病例納入標準[3]:①所有CHD患者均符合新版美國心臟病學會(ACC)/美國心臟病協會(AHA)指南制定CHD診斷標準;②均經冠脈造影檢查確診;③年齡>18周歲;④入組前14 d內尚未接受任何藥物治療。排除標準:①合并重大感染或免疫系統疾病者;②伴有重大臟器功能不全者;③既往有心臟手術史者;④合并惡性腫瘤者。入組人員已在知情同意書上簽字,醫院的倫理委員會已核準。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本獲取及處理:采集研究組入院后翌日清晨空腹靜脈血以及對照組入院當天空腹靜脈血8 ml,分裝為3、5 ml/管,前者保存至-20 ℃冰箱中備用,用以ApoAⅡ-265T/C基因多態性檢測。后者則于抽血后2 h進行離心處理,離心條件為3000 rpm,時長為10 min,獲取血清用作脂代謝指標和ApoAⅠ、ApoB水平的測定。

1.2.2 ApoAⅡ-265T/C基因多態性檢測:置于添加有乙二胺四乙酸和三鉀鹽(EDTA-K3)的抗凝真空試管中,以3000 r/min離心5 min,留取中間白細胞層,約150 μl,加入等體積超純水后混勻,后加入與混勻后體積相等的NaI溶液6 mol/L,旋渦15 s,再加入與前面液體混合后的等體積氯仿:異丙醇(24∶1)旋渦混勻,以12000 r/min離心10 min,留取上層液體,加入異丙醇后靜置10 min,再次12000 r/min離心10 min,保留下層沉淀,獲得基因組DNA。獲取的基因組DNA加入37%異丙醇沉淀,室溫下晾干后加入TE溶液,保存于-20 ℃。將帶有TE溶解液基因組的DNA加入蒸餾水1 ml混勻,以紫外分光光度計上測定260、280 nm處吸光度。設計DNA引物序列,由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,正向引物:5’-CTAGGGTTGATATGTCAGAGC-3’,反向引物:5’-TCAGGTGACAGGGACTATGG-3’,將干粉形式引物以超速離心機3000 r/min離心3 min后,設定反應體系:超純水12.5 μl,10×Buffer 5 μl,MgCl22 μl,dNTPs 1 μl,正反向引物各2 μl,模板DNA 4 μl,Taq酶0.5 μl,ddH2O 1 μl至總體積30 μl;PCR擴增,95 ℃6 min,94 ℃ 25 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 50 s,重復40個循環,再次72 ℃延伸8 min。PCR產物10 μl和限制性內切酶BsmI依次加入0.5 ml Eppendorf管中混勻,65 ℃孵育12 h過夜,保存于4 ℃環境。酶切產物片段以3%瓊脂凝膠電泳,DNA樣品與10×DNA Loading Bufer按照9∶1比例混合后上樣,最后獲得273、215 bp和58 bp DNA片段。

1.2.3 生化指標檢測:通過7060型全自動生化分析儀及其配套試劑盒完成脂代謝指標的檢測,相關指標涵蓋甘油三酯(TG),總膽固醇(TC),低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C),高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。以免疫透射法檢測ApoAⅠ和ApoB,于340 nm波長處進行比色。

1.2.4 冠脈造影:選擇橈動脈穿刺,置入導絲與6F動脈鞘管,過程中沿側管注入普通肝素2500 U。操作過程中一旦遭遇阻力則應撤出導絲,以1∶1比例完成造影劑與0.9%氯化鈉溶液的稀釋,之后推入造影導管,完成血管解剖形態的觀察。

1.2.5 分組方式[4]:所有CHD患者根據Gensini評分的差異分為輕度狹窄組(≤20分)、中度狹窄組(>20分且≤45分)及重度狹窄組(>45分)。評分標準如表1所示。

表1 冠脈造影Gensini評分標準

1.3 評價指標 比較研究組和對照組ApoAⅡ-265T/C基因多態性、血清脂代謝指標水平。分析不同冠脈狹窄程度CHD患者ApoAⅡ-265T/C基因多態性、血清脂代謝指標水平。

2 結 果

2.1 CHD組及對照組脂類代謝指標水平比較 CHD組血清ApoAⅠ及ApoB水平均低于對照組(均P<0.05),見表2。

表2 CHD組及對照組脂類代謝指標水平比較(mmol/L)

2.2 兩組ApoAⅡ-265T/C基因多態性比較 ApoAⅡ-265T/C多態性CC+CT基因型頻率、C等位基因型頻率高對照組,差異有統計學意義(均P<0.05),見表3。

表3 兩組ApoAⅡ-265T/C基因多態性比較

2.3 不同冠脈狹窄程度CHD患者的ApoAⅡ-265T/C基因多態性比較 中/重度狹窄組患者的CC+CT基因型頻率、C等位基因頻率均高于輕度狹窄組,差異有統計學意義(均P<0.05),見表4。

表4 不同冠脈狹窄程度CHD患者的ApoAⅡ-265T/C基因多態性比較

2.4 不同冠脈狹窄程度CHD患者的脂類代謝指標水平比較 中/重度狹窄組血清ApoAⅠ及ApoB水平均低于輕度狹窄組,差異有統計學意義(均P<0.05),見表5。

表5 不同冠脈狹窄程度CHD患者的脂類代謝指標水平比較(mmol/L)

2.5 CHD患者冠脈狹窄程度影響因素的多因素Logistic回歸分析 以CHD患者冠脈狹窄程度為因變量,賦值如下:輕度狹窄=0,中/重度狹窄=1。以血清ApoAⅠ、ApoB水平以及ApoAⅡ-265T/C基因多態性為自變量,賦值如下:以血清ApoAⅠ、ApoB水平均為原值輸入;CC+CT基因型頻率=1,非CC+CT基因型頻率=0;C等位基因型=1,非C等位基因型=0。經多因素Logistic回歸分析發現,CC+CT基因型頻率以及C等位基因型均是CHD患者冠脈中/重度狹窄的危險因素(均P<0.05),見表6。

表6 CHD患者冠脈狹窄程度影響因素多因素Logistic回歸分析

3 討 論

CHD主要包括缺血性心力衰竭、心絞痛、心肌梗死以及猝死等類型,血脂代謝紊亂是CHD的重要危險因素之一,主要包括TG、TC、LDL-C的升高及HDL-C的降低[5]。TG、TC等水平升高可促進LDL-C為主的脂質顆粒沉積于動脈血管內膜內皮下并形成脂質堆積,而HDL-C的下降增加了將膽固醇運轉至肝臟排泄的難度,且對機體的抗炎、抗氧化作用降低,從而促進斑塊形成,堵塞血管管腔,導致血管狹窄,斑塊破裂后形成血栓,造成管腔堵塞,最終引發CHD相關疾病[6]。Apo屬于HDL的重要組成部分之一,有研究表明,Apo對血脂代謝以及利用均會產生一定的影響,繼而介導高脂血癥、CHD及心腦血管疾病的發生和發展[7]。ApoAⅡ是HDL顆粒中的主要載脂蛋白之一,能夠維持HDL的結構,且可通過水解乳糜微粒(CM)和極低密度脂蛋白(VLDL)中的TG和磷脂(PL),抑制卵磷脂-膽固醇乙酰轉移酶(LCAT)活性,激活肝脂酶[8],故此ApoAⅡ與心血管疾病的相關研究成為熱點。

本文結果發現,CHD組血清ApoAⅠ及ApoB水平均低于對照組。這提示了CHD患者血清ApoAⅠ及ApoB水平存在明顯的下調。考慮原因,ApoAⅠ屬于HDL重要載脂蛋白之一,于HDL成熟以及膽固醇逆回轉運過程中起著至關重要的作用,HDL又可抑制動脈壁平滑肌細胞對LDL-C的攝取,進一步避免膽固醇在細胞內的大量堆積[9]。ApoB屬于LDL的重要載脂蛋白,其可識別廣泛分布在肝、動脈壁細胞等組織細胞表面的LDL受體,進一步影響機體脂代謝,間接參與CHD的發生、發展過程[10-12]。此外,ApoAⅡ-265T/C多態性CC+CT基因型頻率、C等位基因型頻率高對照組,差異有統計學意義。這反映了CHD患者ApoAⅡ-265T/C多態性相較于正常健康者有明顯差異。究其原因,ApoAⅡ-265T/C基因會通過對ApoAⅠ的表達進行調控,進一步對下游HDL的代謝產生影響。然而,但ApoAⅡ-265T/C基因型朝C等位基因型方向偏移時,其對ApoAⅠ的表達調控作用赫然發生變化,可能促使其原本調節HDL代謝的作用減弱甚至喪失,從而引起HDL代謝異常的發生,從而促進了CHD的發生、發展[13-15]。另外,中/重度狹窄組患者的CC+CT基因型頻率、C等位基因頻率均高于輕度狹窄組,差異有統計學意義。分析原因,隨著ApoAⅡ-265T/C基因CC+CT基因型頻率的增加,該基因對HDL代謝相關基因的調控能力異常,間接導致了HDL的代謝異常,從而使得HDL-C水平降低,致使其抗動脈粥樣硬化作用減弱,促進了病情的進展[16-18]。同時,中/重度狹窄組血清ApoAⅠ及ApoB水平均低于輕度狹窄組。其中主要原因,可能是ApoAⅠ及ApoB表達的降低會導致兩者功能發生改變,進一步影響HDL的代謝,使得機體血脂代謝以及利用發生異常,介導了CHD的發生、發展[19-20]。經多因素Logistic回歸分析發現,CC+CT基因型頻率以及C等位基因型均是CHD患者冠脈中/重度狹窄的危險因素。這充分說明了ApoAⅡ-265T/C多態性和CHD患者冠脈狹窄程度有關,值得臨床關注。

綜上所述,CHD患者存在ApoAⅡ-265T/C基因CC+CT基因型頻率以及C等位基因型頻率較高的特點,均和CHD患者中/重度狹窄有關。