白細胞介素-6-572C-G基因多態性與小兒復雜型熱性驚厥及癥狀發作后腦損傷關系臨床研究

武文娟,韓 偉

(陜西省人民醫院兒童病院,陜西 西安 710068)

熱性驚厥(Febrile convulsion,FS)是好發于6個月至5歲兒童的神經內科疾病,病情容易反復,其中復雜型FS(Complex FS,CFS)是小兒熱性驚厥的嚴重類型,其相較于單純型FS,驚厥發作頻率增多,持續時間延長,故患兒腦組織損傷風險更高[1],患兒可能會轉變為癲癇,甚至出現智力低下或行為及異常等腦損傷性疾病[2]。影響CFS發作后腦損傷因素較多且復雜,目前關于其機制尚未十分明確。以往在小兒FS發病機制探究中發現,FS發生除與遺傳因素有關外,還與機體免疫炎癥反應異常有關[3]。單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism,SNP)是人類遺傳變異中最常見類型,臨床被報與多種疾病發生、發展和轉歸密切相關[4-5]。白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)是臨床研究較多的與小兒FS發生有關習慣的細胞因子,目前研究已明確其上調及其基因多態性與FS發生有關[6-7]。然而,以往針對IL-6基因多態性分析的研究對象多為FS[3,7],尚缺少IL-6-572C-G基因多態性與具體CFS發生及發作后腦損傷關系的數據報道。鑒于此,本研究對IL-6-572C-G基因多態性與小兒CFS及發作后腦損傷的相關性進行分析,以期為此類患兒診療及預后改善提供更為科學的依據,現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年3月至2022年12月在本院接受診治的FS患兒150例為研究對象,其中62例為單純型FS(單純組),88例為CFS(復雜組)。病例納入標準:首次發病;符合《熱性驚厥診斷治療與管理專家共識(2016)》中有關FS的診斷標準[8];獲得患兒監護人和自身同意,并簽署知情協議書。排除標準:其他類型驚厥;伴有顱腦實質性損傷或其他可能引發腦損傷性疾病;合并其他嚴重基礎性疾病;合并血液系統疾病。同時收集在兒保科接受健康體檢且顯示各項功能指標正常的50例兒童作為對照組。單純組男孩30例,女孩32例;年齡5個月至6歲,平均(2.80±0.81)歲;病程2～7 d,平均(3.00±0.98)d;體溫37.7～40.8 ℃,平均(38.79±1.18)℃;發熱原因:上呼吸道感染41例,急性胃腸炎8例,中毒性菌痢3例,其他10例。復雜組男孩44例,女孩44例;年齡6個月至7歲,平均(2.84±0.81)歲;病程1～6d,平均(2.77±0.92)d;體溫37.5～41.5 ℃,平均(38.80±1.29)℃;發熱原因:上呼吸道感染60例,急性胃腸炎11例,中毒性菌痢2例,其他15例。對照組男孩26例,女孩24例;年齡5個月至6歲,平均(2.84±0.84)歲。三組受試兒上述基線資料間比較差異均無統計學意義(P>0.05),具有可比性。

1.2 研究方法 收集三組受試兒肘靜脈血樣1～2 ml,置入內含乙二胺四乙酸的抗凝管中,離心分離血漿,剩余血細胞中加入人紅細胞裂解液,震蕩混勻3 min,再次離心,棄上清液,留白細胞沉淀,-80 ℃冷藏待用。①DNA提取:賽默飛提供的DNA zol試劑提取受試兒基因組DNA。②目標標DNA擴增:Thermofisher ABI 7500實時熒光定量PCR儀對DNA進行擴增,引物序列(正向引物:5’-GGAGACGCCTTGAAGTAACTGC-3’,反向引物:5’-GAGTTTCCTCTGACTCCATCGCAG-3’)由上海生物工程公司提供;反應體系:模板DNA 1 μl、dNTP (10 mmol/L)1 μl、正反向引物(20 μmol/L)各1 μl、10×Bueffer緩沖液3 μl、TaqDNA聚合酶1.5 μg、MgCl2(1.5 mmol/L)3 μl,滅菌去離子定容至30 μl;反應條件:94 ℃預變性10 min,變性60 s,65 ℃退火60 s,72 ℃延伸90 s,35個循環后,72 ℃條件下再次延伸10 min。③目標DNA分離測定:取10 μl PCR產物實施瓊脂糖凝膠電泳,電泳后凝膠置于0.5 μg/ml溴乙錠中染色,SDS 2.4軟件分析目標基因分型,酶切條帶為163 bp=C/C基因型,163、101、62 bp=C/G基因型,101、62 bp=G/G基因型[9]。

1.3 觀察指標 ①比較三組的IL-6基因多態性;②統計復雜組患兒發作后腦損傷情況,即高熱驚厥期間和體溫正常14 d后患兒腦電圖均明顯異常,驚厥后伴神經癥狀或癲癇發作,比較腦損傷和無腦損傷患兒性別、年齡、病程、發熱體溫、抽搐持續時間、發熱原因、抽搐范圍、血清IL-6水平和IL-6基因型頻率;③分析影響CFS患兒發作后腦損傷發生的危險因素。

1.4 統計學方法 采用 SPSS 22.0統計學軟件進行分析。計量資料以(均數±標準差)表示,組間比較用單因素方差分析,兩間比較用t檢驗,不符合正態分布[M(Q1,Q3)]Mann-WhitneyU檢驗;計數資料以[例(%)]表示,組間比較用χ2檢驗;危險因素分析用Logistic回歸分析;P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組IL-6基因多態性分布比較 三組IL-6基因CC、CG、GG頻率和等位基因C和G表達頻率間比價差異具有統計學意義(均P<0.05),復雜組CC基因型頻率和C等位基因頻率明顯低于單純組,單純組明顯低于對照組(均P<0.05),復雜組GG基因型頻率和G等位基因頻率高于單純組,單純組高于對照組(均P<0.05),復雜組和單純組CG基因型頻率均高于對照組(均P<0.05)。見表1。

表1 三組IL-6基因多態性分布比較[例(%)]

2.2 復雜組腦損傷組與無腦損傷者組IL-6基因多態性分布比較 見表2。復雜組發作后腦損傷患兒CC基因型頻率和C等位基因頻率明顯低于無腦損傷者,GG基因型頻率和G等位基因頻率高于無腦損傷者(均P<0.05)。

表2 復雜組腦損傷組與無腦損傷者組IL-6基因多態性分布比較[例(%)]

2.3 復雜組腦損傷組與無腦損傷者組一般資料比較 復雜組發作后無腦損傷患兒與腦損傷患兒男孩、年齡、病程、發熱體溫、發熱原因分布情況間比較差異均無統計學意義(均P>0.05),發作后腦損傷患兒抽搐持續時間>15 min者、全身抽搐占比和血清IL-6水平均明顯高于無腦損傷患兒(均P<0.05)。見表3。

表3 復雜組腦損傷組與無腦損傷者組一般資料比較

2.4 影響CFS發作后腦損傷的危險因素 以是否出現發作后腦損傷為因變量Y(賦值:否=0,是=1),抽搐持續時間、抽搐范圍、血清IL-6水平和IL-6基因多態性為自變量X(賦值:抽搐持續時間<15 min記0,≥15 min記1;抽搐范圍局部記0,全身記1,IL-6基因多態性CC記0,CG+GG記1,血清IL-6原值帶入),進行Logistic回歸分析。結果顯示,抽搐持續時間≥15 min、全身抽搐、IL-6基因型CG+GG和IL-6水平升高均是患兒發作后腦損傷形成的危險因素(均P<0.05)。見表4。

表4 影響CFS發作后腦損傷的Logistic回歸分析

3 討 論

小兒CFS起病急,抽搐時間長,抽搐次數頻繁,發作后腦損傷風險較單純FS高,導致后續治療難度增加[10]。目前,雖已有較多關于FS的研究[5,7],但對于CFS發病和發作后腦損傷形成機制尚未完全明確。發熱是FS所共有的病理基礎,IL-6、TNF-α等多種炎癥介質在發熱中扮演重要角色。以往眾多研究證實,FS腦脊液和外周血中IL-6水平顯著高于發熱對照組和健康對照組[6,11],同時其發病與IL-6相應SNP亦存在相關性[12]。劉占國等[13]在膿毒癥病情進展機制研究中顯示,中樞神經損傷亦與血清IL-6有關,后者可作為膿毒癥性腦損傷動態監測的潛在標志物。陳文園[14]提出,IL-6表達水平監測可能有助于在早期區分單純型FS與CFS。

既往研究指出,亞洲人群中,IL-6-572C-G中以C等位基因占主導地位[15],而G等位基因則常見于高加索居民中[16]。本研究對比顯示,與健康對照小兒比較,CFS、單純型FS患兒IL-6的CC基因型和C等位基因頻率均明顯下降,GG基因型和G等位基因頻率均明顯升高,與楊躍萍、李珍等報道結果存在相似性[3-7]。同時,CFS與單純型FS患兒IL-6相應基因型和等位基因頻率亦存在明顯差異(均P<0.05)。提示G等位基因表達可能是FS發生的易感基因,更是CFS發生發展的易感基因。分析原因可能與攜帶G等位基因的基因位點IL-6啟動子活性強,轉錄活性高,導致機體炎癥反應增強,大腦溫度升高[17];此外,炎癥反應增強會對機體免疫防御機制造成損傷,增加患兒感染風險,引起感染后發熱,這些均會增加CFS危險性[18]。

長時程驚厥和持續性全身抽搐可引起短暫或長期大腦功能障礙,產生神經中樞后遺癥[18]。CFS較單純FS患兒病情更為兇險,患兒更易出現發作后腦損傷,嚴重影響小兒生長發育,導致其學習能力下降。IL-6屬于細胞信號分子,主要由T細胞分泌,可刺激B細胞釋放免疫球蛋白和其他炎癥介質釋放。張玉松等[11]在FS大鼠海馬組織中發現IL-6上調表達,IL-6啟動子區域甲基化水平下降。Gallentined等[19]研究顯示,在FS持續所致腦損傷預測方面,IL-6價值高于IL-1β。本研究對比顯示,與無腦損傷者比較,CFS發作后腦損傷患兒CC基因型頻率和C等位基因頻率明顯下降,而GG基因型頻率和G等位基因頻率明顯升高,CG+GG基因型表達是患兒發作后腦損傷形成的危險因素之一(均P<0.05),與Azab等[12]報道結果相似。分析原因,腦損傷形成和發展與機體免疫炎癥反應等有關。IL-6、腫瘤壞死因子-α等是大腦某些刺激作用下所釋放的強有力的致熱源,可影響神經元興奮性[20-21]。G等位基因出現,導致IL-6啟動子區域去甲基化,IL-6基因大量轉錄反應,積累釋放的IL-6及其刺激活化的其他炎癥細胞和介質會造成炎癥反應級聯放大,引起大腦神經異常放電,從而增加腦損傷風險。

綜上所述,CFS患兒IL-6基因型表達狀態不同于單純型FS,等位基因由正常的C為主轉變為G為主,且CG+GG基因型上調表達與發作后腦損傷形成有關,是CFS發作后腦損傷形成的危險因素之一。