微小miR-184在調控女性滋養層細胞凋亡中的作用及其分子機制探究

徐 霞,王鵬程,韓 璐

(上海交通大學醫學院蘇州九龍醫院,江蘇 蘇州 215000)

人類胎盤的侵襲性絨毛外滋養層與成功的妊娠結局密切相關。它們重塑子宮螺旋動脈,以增加流向胎盤和發育中胎兒的血流和氧氣輸送[1-2]。滋養層細胞系的細胞活動,如滋養層的增殖、分化、遷移和侵襲,是健康妊娠的關鍵。由于滋養層侵襲與螺旋動脈重塑相關,甚至是其關鍵,而螺旋動脈重塑是成功胎盤形成的先決條件[3]。與上皮間質轉化標志物(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相關的一些特征已被證實,波形蛋白和N-鈣黏蛋白作為間充質細胞的強制性標記,迄今為止尚未在EVT亞群中報道[4]。此外,據報道,兩種非經典鈣黏蛋白,血管內皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)和鈣黏蛋白-11(CDH-11)在人類胎盤滋養層細胞中表達。CDH-11和VE-cadherin被描述為ST和EVT的特征。已有研究表明,幾種miRNA通過靶向不同的基因對HTR-8/SVneo細胞的凋亡產生調節作用,如靶向胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的miR-30a-3p[4]、靶向肝細胞受體B4(EPHB4)[5]的miR-454,miR-320a靶向肝臟雌激素相關受體γ(ERRγ)[6],miR-423-5p靶向胰島素樣生長因子2mRNA結合蛋白1(IGF2BP1)[7],微小RNA-184(miR-184)靶向趨化因子12(CXCL12β)[8],miR-184靶向野生型p53誘導基因1(WIG1)[9]miR-210靶向Notch跨膜受體-1(NOTCH1)[10]。原位雜交顯示,滋養層在胎盤中表達miR-184[11],而唐氏綜合征胎兒胎盤中miR-184的表達上調[12]。在早發性重度子癇前期,miR-184通過靶向鞘氨醇1磷酸酯裂解酶1(SGPL1)增強滋養層細胞產生(IL-8)[13]。然而,miR-184在滋養層細胞中的功能仍不清楚[14]。本文進一步從女性滋養層細胞組織中miR-184表達水平、外源性miR-184表達水平,以及miR-184對細胞增殖、凋亡的影響進行研究,以全面掌握miR-184在女性滋養層細胞組織中的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 試劑:HTR8/SVneo、Swan71和正常的上皮組織細胞,胎牛血清,頭孢噻嗪(HT),300 μg/ml,100 mmol/L Tris-HCl(pH7.5),5 mol/L EDTA緩沖液,堿性裂解液:0.2 mol/L NaOH,1% SDS乙酸鈉:3 mol/L KAc(pH 4.8);異丙醇70%乙醇;溴酚藍,蔗糖指示劑。 TBE緩沖液,1%瓊脂糖,溴化乙錠。 PI母液:500 μg/ml; Ho33342母液:2 mmol/L。

1.1.2 儀器和設備:熒光顯微鏡,電泳儀,電泳槽,微量取樣器(1 ml,100 μl)0.5、1.5 ml離心管,載玻片,蓋玻片。

1.2 實驗方法 ①使用DMEM培養基、RPMI1640培養基、胎牛血清(10%)、制作細胞培養基進行樣本細胞培養。②在培養基中添加10%的胎牛血清、青霉素、鏈霉素,將采集的女性滋養層細胞組織樣本細胞在37 ℃和5%的CO2條件下進行培養。③將si-miR-184轉染到女性滋養層細胞組織腺細胞HTR8/SVneo、Swan71中,完成轉染后繼續培養,同時設置空白載體和陰性對照組(Si-NC)一起進行培養,培養周期為2 d。④提取PCR進行反轉錄,以Primescript和SYBR primixextaq試劑作為轉錄試劑進行轉錄效率檢測,對其轉染率進行定量的檢測和數據記錄。

2 結 果

2.1 女性滋養層細胞組織中miR-184表達水平 在HTR8/SVneo細胞、Swan71細胞及正常細胞中miR-184表達水平依次為3.27±0.51、1.57±0.22、1.00±0.23,比較差異有統計學意義(均P<0.05)。

2.2 女性滋養層細胞組織細胞中外源性miR-184表達水平 見圖1。從結果可以看出,在正常上皮細胞中miR-184在轉染后的細胞表達水平要比轉染前低,而在女性滋養層細胞組織miR-184的表達水平比轉染前的要高。并且從其相對表達量的直方圖來看,相對表達量呈現明顯的差異,在miR-184組中表現更為明顯。經2 d的轉染siR-NA后,miR-184在A549與HTR8/SVneo兩種細胞中的表達水平比在轉染之前更低(均P<0.05)。經2 d的轉染pcDNA3．1-miR-184后,miR-184在A549細胞中的表達水平比轉染之前更高(均P<0.05)。

A為上皮組織細胞組織;B為女性滋養層細胞組織中miR-184的表達

2.3 miR-184表達水平對細胞增殖的作用 si-miR-184促使miR-184的表達能夠抑制HTR8/SVneo和Swan71細胞的增殖。在HTR8/SVneo細胞中,各時間段si-miR-184的吸光值與si-NC比較差異無統計學意義(均P>0.05),在A549細胞中,各時間段si-miR-184的吸光值明顯低于si-NC(P<0.05)。見圖2。

圖2 miR-184表達水平對細胞增殖的作用

2.4 miR-184表達水平對細胞凋亡的作用 利用si-miR-184的轉染降低miR-184的表達水平能夠阻礙女性滋養層細胞的凋亡作用(P<0.01),而miR-184的過度表達能夠明顯推動女性滋養層細胞的凋亡作用(P<0.01)。見圖3。

圖3 miR-184表達水平對細胞凋亡的作用

3 討 論

女性滋養層細胞凋亡是胎盤發育過程中發生的程序性細胞死亡,其潛在的調節機制負責胎盤的穩態。這些凋亡過程的改變可導致胎盤功能障礙,并導致各種病理狀況。miRNA是破壞mRNA和(或)誘導翻譯抑制的重要轉錄后調節因子,其在胎盤形成過程中調節滋養層細胞凋亡中起著關鍵作用[15]。然而,在女性滋養層細胞凋亡過程中,miRNA參與的分子調控機制仍不清楚。在本研究中,我們發現miR-184通過靶向髓細胞白血病基因1(MCL1)在調節HTR-8/SVneo細胞凋亡中起作用。越來越多的證據表明,miR-184在誘導多種細胞(主要是免疫細胞和腫瘤細胞)凋亡方面發揮著關鍵作用[16]。已有研究分析了miR-184在HTR-8/SVneo細胞中誘導凋亡,這表現出滋養層細胞的特征,滋養層細胞表達miR-184,在所謂的胎盤中觀察到特別強烈的表達,但在胎盤中被IUGR下調。已有研究結果表明,miR-125可能參與正常胎盤形成和妊娠相關并發癥,這些并發癥通過誘導滋養層細胞凋亡而發生。

本文利用定量的反轉錄PCR技術滋養層細胞組織中miR-184的表達,通過測定miR-184在HTR8/SVneo和Swan71兩種細胞中的相對表達水平作為女性滋養層細胞組織中miR-184表達水平[17]。測定經2 d培養周期的轉染siR-NA后,miR-184在A549與HTR8/SVneo兩種細胞中的表達水平作為女性滋養層細胞組織細胞中外源性miR-184表達水平。在HTR8/SVneo細胞中對各時間段si-miR-184的吸光值與si-NC差異分析miR-184表達水平對細胞增殖的作用,最后通過si-miR-184的轉染方式降低miR-184的表達水平觀察對女性滋養層細胞的凋亡影響[18]。

從實驗結果來看,miR-184在HTR8/SVneo和Swan71兩種細胞中的相對表達水平比在正常的上皮組織細胞中更高;在A549細胞中的相對表達水平比在正常的上皮組織細胞中更低;經2 d的轉染siR-NA后,miR-184在A549與HTR8/SVneo兩種細胞中的表達水平比在轉染之前更低。同時通過細胞增殖對比實驗,發現經2 d的轉染真核表達載體pcDNA3.1的miR-184后,miR-184在A549細胞中的表達水平比轉染之前更高(均P<0.05)。 轉染miR-184促使miR-184的表達能夠抑制HTR8/SVneo和Swan71細胞的增殖[19]。 在HTR8/SVneo細胞中,各時間段si-miR-184的吸光值與si-NC比較差異無統計學意義(均P>0.05),在A549細胞中,各時間段si-miR-184的吸光值明顯低于si-NC(P<0.05);在進行的凋亡實驗中,利用si-miR-184的轉染降低miR-184的表達水平能夠阻礙女性滋養層細胞的凋亡作用,而miR-184的過度表達能夠明顯推動女性滋養層細胞的凋亡作用[20]。

綜上所述,實驗結果表明可以通過從表達水平、細胞增殖和凋亡等多方面綜合系統的分析了miR-184在女性滋養層細胞組織中的表達機制和其對細胞的增殖凋亡的影響,對后續進一步對女性滋養層細胞組織疾病的預防、治療和早發現具有非常重要的參考價值。通過抑制miR-184表達可以調控和誘導滋養層的細胞凋亡的保護作用,臨床上可以采用miR-184調節方式調控其滋養層細胞的凋亡來對滋養層細胞異常導致的相關疾病進行預防和治療。