丹芪護肝方對肝纖維化模型大鼠TGF-β/Smad4信號通路的影響

彭馥芝 徐儀昕 蔣 堃 陳思源 余曦明 張 逢 余望貽

湖南中醫藥大學科技創新中心，湖南長沙 410208

肝纖維化是肝臟對自身免疫性、病毒性、藥物性等多種慢性損傷的病理性修復反應[1-2]。其發生的中心事件是：在各種慢性損傷因素影響下，肝星狀細胞被活化，轉化為肌成纖維細胞，與肝臟微環境中的淋巴細胞、內皮細胞等協同作用，通過自分泌等方式共同促進肝臟炎癥及纖維化進程[3-4]。因此，在肝纖維化的發生和發展過程中，許多細胞因子以及細胞內的各種信號通路均能對其產生影響[5-8]。丹芪護肝方由丹參、黃芪、女貞子等組成，具有平肝清熱，活血行氣的功效，臨床上用于慢性乙型肝炎和濕熱血瘀兼腎虛者，但尚未發現有文獻報道丹芪護肝方對肝纖維化的影響。本研究通過制備大鼠肝纖維化動物模型，探討丹芪護肝方對肝纖維化的保護作用。并通過檢測轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）/信號通路通用調節因子4（SMAD family member 4，Smad4）信號通路變化，初步揭示丹芪護肝方對肝纖維化的可能機制，以期為臨床診療上丹芪護肝方的應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級SD（sqrague dawley）大鼠48只，雌雄各半，體重140～160 g（實驗動物質量合格證號：430727211100469235），購自湖南斯萊克實驗動物有限公司[許可證號：SCXK（湘）2019-0004]；飼養于湖南中醫藥大學實驗動物中心，自由進食及飲水，溫度20～25℃，相對濕度為55%～65%。本實驗經湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準通過（倫理號：LL2021031704）。

1.2 實驗藥物與試劑

聯苯雙酯滴丸（批號：A02J181131）；四氯化碳（批號：C11588428）；大豆油（批號：C17900081）；逆轉錄試劑盒（PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser，批號：RR047B）；染料法熒光定量試劑盒（SYBR?Premix Ex Taq?Ⅱ，批號：RR82LR）；Trizol總RNA提取試劑（批號：DP424）；平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）（批號：BS-10196R）、TGF-β1（批號：BS-0086R）、Smad4（批號：BS-0585R）單克隆抗體；RIPA裂解緩沖液（批號：JH-23075）；BCA（bicinchoninic acid assay）；蛋白定量試劑盒（批號：FV-87028354）；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）凝膠配制試劑盒（批號：20197701）。

1.3 動物造模及給藥

48只SD大鼠被隨機分為正常對照組、模型組、聯苯雙酯組（陽性藥物對照組）、丹芪護肝方組，每組12只。四氯化碳（CCL4）與大豆油按比例配成40% CCL4混合溶劑后，2次/周，腹腔注射8周，制備大鼠肝纖維化模型。丹芪護肝方由丹參10 g、黃芪12 g、女貞子10 g、白花蛇舌草30 g、白芍15 g、郁金10 g組成。所有藥材均從湖南中醫藥大學第一附屬醫院統一購買，在湖南中醫藥大學藥學院實驗室煎制。將所有藥材放入適量水中進行濃煎至200 ml，口服，1 次/d。根據不同種屬動物間用藥劑量換算系數[9]（參照60 kg成人進行等效劑量換算），自造模之日起，聯苯雙酯組（50 mg/kg）和丹芪護肝方組（9.14 g/kg）給予相應藥物治療，模型組和正常對照組灌胃等體積的生理鹽水，1 次/d，連續8周。

1.4 肝臟指數測定

末次給藥后禁食24 h，2%的戊巴比妥鈉（2 ml/kg）進行腹腔注射麻醉。腹主動脈取血后立即摘取肝臟，經沖洗、濾紙吸干水分后稱量濕重并計算肝臟指數：臟器指數=臟器濕重（g）/大鼠體質量（g）×100%。

1.5 肝功能測定

麻醉后腹主動脈取血，室溫靜置2 h，于4 ℃，3500 r/min，離心15 min后取血清使用全自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，T-BiL）、直接膽紅素（direct bilirubin，D-BiL）。

1.6 逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測肝組織中α-SMA、TGF-β1和Smad4 mRNA表達

提取各組大鼠肝組織中總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），檢測RNA完整性和純度后，進行RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）擴增。RT-PCR擴增條件為：95℃預變性30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s擴增，40個循環；55～95℃熔解30 s。采用2-△△Ct公式計算α-SMA、TGF-β1及Smad4 mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列信息

1.7 蛋白免疫印跡（western blot，WB）檢測肝組織中α-SMA、TGF-β1和Smad4蛋白表達

提取各組大鼠肝臟組織蛋白，采用BCA法對各組蛋白樣品進行定量。SDS-PAGE電泳結束后，將蛋白濕轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜封閉2 h。封閉完成后，用α-SMA（1∶10000）、TGF-β1（1∶1000）、Smad4（1∶2000）、GAPDH（1∶10000）抗體孵育過夜。等滲緩沖鹽溶液（TBS with Tween-20，TBST）洗滌以除去殘留的一抗，二抗室溫孵育1.5 h，TBST洗滌后，放入化學發光成像儀內化學發光顯影。

1.8 統計學方法

使用SPSS 22.0統計學軟件進行數據統計分析，差異顯著性用單因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan法進行多重比較。計量資料以均數±標準差（）表示，P＜ 0.05為差異有統計學意義，P＜ 0.01為差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 丹芪護肝方對肝臟指數的影響比較

與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟指數升高，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。與模型組比較，聯苯雙酯組和丹芪護肝方組肝臟指數均降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表2 丹芪護肝方對肝纖維化大鼠肝臟指數的影響（ ± s）

表2 丹芪護肝方對肝纖維化大鼠肝臟指數的影響（ ± s）

注 與正常對照組比較，▲P ＜ 0.05；與模型組比較，★P ＜ 0.05，★★P ＜ 0.01

組別 n 肝重（g） 肝臟指數（%）正常對照組 12 16.94±0.97 3.14±0.41模型組 12 21.42±1.50▲ 5.11±0.49▲聯苯雙酯組 12 18.86±1.16★★ 4.54±0.58★丹芪護肝方組 12 19.89±0.65★ 4.39±0.58★

2.2 丹芪護肝方對肝功能的影響比較

模型組大鼠血清中ALT、AST、T-BiL、D-BiL含量與正常對照組比較，均顯著升高，差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01）；與模型組比較，聯苯雙酯組和丹芪護肝方組大鼠肝功能指標ALT、AST、T-BiL、D-BiL含量均明顯下降，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表3。

表3 丹芪護肝方對肝纖維化大鼠肝功能的影響（ ± s）

表3 丹芪護肝方對肝纖維化大鼠肝功能的影響（ ± s）

注 ALT：丙氨酸氨基轉移酶；AST：天冬氨酸氨基轉移酶；T-BiL：總膽紅素；D-BiL：直接膽紅素；與正常對照組比較，▲P ＜ 0.05，▲▲P ＜ 0.01；與模型組比較，★P ＜ 0.05，★★P ＜ 0.01

組別 n ALT（U/L） AST（U/L） T-BiL（μmol/L） D-BiL（μmol/L）正常對照組 12 46.18±3.92 27.31±2.23 0.71±0.11 0.78±0.09模型組 12 192.36±7.79▲▲ 83.12±5.26▲▲ 2.77±0.35▲▲ 2.15±0.21▲▲聯苯雙酯組 12 101.37±5.14★★ 49.94±3.78★★ 2.17±0.21★ 1.97±0.22★丹芪護肝方組 12 115.66±4.98★★ 53.74±3.37★ 2.16±0.32★ 1.84±0.19★

2.3 丹芪護肝方對肝纖維化大鼠肝組織 α-SMA表達的影響比較

模型組大鼠肝組織α-SMA mRNA和蛋白表達與正常對照組比較均升高，差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01），提示肝星狀細胞被激活，肝纖維化發生。與模型組比較，聯苯雙酯組和丹芪護肝方組大鼠肝組織α-SMA mRNA和蛋白表達量均降低，差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01）。見圖1。

圖1 丹芪護肝方對肝纖維化大鼠肝組織α-SMA表達的影響

2.4 丹芪護肝方對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β/Smad4信號通路的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織TGF-β1、Smad4 mRNA及蛋白相對表達量升高，差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01）；與模型組比較，聯苯雙酯組和丹芪護肝方組大鼠肝組織TGF-β1、Smad4 mRNA和蛋白相對表達量降低，差異有顯著統計學意義（P＜ 0.01）；聯苯雙酯組TGF-β1、Smad4蛋白及mRNA表達均低于丹芪護肝方組，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見圖2。

圖2 丹芪護肝方對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1、Smad4表達的影響

3 討論

目前中醫藥治療以其獨特的優勢，成為研究肝纖維化防治的重要方向之一。丹芪護肝方以丹參、黃芪為疏肝要藥，疏泄肝氣，調暢氣機；配伍女貞子、蛇舌草、白芍、郁金，調和諸藥共為佐使。全方合用具有疏泄氣機，化瘀活血的作用。

肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）是一種肝間質細胞，HSC被激活后能合成并分泌細胞外基質，產生膠原酶，成為肝纖維化發生、發展的中心環節[10-11]。研究表明，當α-SMA表達水平升高時，HSC被激活，進而誘導肝纖維化的發生[12-13]。本研究發現，肝纖維化模型大鼠的α-SMA表達顯著上升，而丹芪護肝方干預后，α-SMA蛋白及mRNA表達水平均明顯下降，提示丹芪護肝方也能通過抑制肝星狀細胞活化來抑制肝纖維化。

TGF-β是目前公認的細胞分化過程中最關鍵的細胞因子，而TGF-β1是目前研究最多的TGF-β亞型，具有廣泛的生物學活性，對細胞增生、遷移、分化及凋亡均有重要影響[14]。研究表明，作為重要的促肝纖維化因子之一，TGF-β1能刺激HSC分泌細胞外基質降解蛋白酶抑制劑，增加細胞外基質沉積，促進成纖維細胞分化，從而引發肝纖維化[15-18]。因此，TGF-β1水平在肝纖維化時最高，通過下調TGF-β1的表達，抑制HSC的活化，減少細胞外基質沉積，進而延緩肝纖維化的進程[19-20]。Smad4是TGF-β1介導纖維化和炎癥的關鍵調節因子[21]。Smad4的條件性缺失可抑制纖維化和TGF-β1誘導的Ⅰ型膠原的表達[22]。研究證實，肝纖維化過程中，各類損傷因子會導致肝臟內TGF-β1表達大量增加，TGF-β1通過與靶細胞表面的TGF-β 受體結合，激活下游信號傳導分子，與Smad4 結合形成多聚體后轉移進入細胞核，在細胞核內與靶基因結合，形成轉錄復合體，被激活的目的基因通過復制、轉錄產生大量膠原，最終形成肝纖維化[23-25]。本實驗研究結果還發現，丹芪護肝方能夠抑制肝纖維化大鼠TGF-β1和Smad4的表達，提示丹芪護肝方可能通過調控TGF-β/Smad4信號通路抑制肝纖維化。

綜上所述，丹芪護肝方能夠通過抑制TGF-β/Smad4信號通路，抑制肝星狀細胞活化，抑制肝纖維化發揮護肝作用。