三葉青查爾酮異構酶基因的克隆及序列分析

鄧思珊 劉洪旭 馬麗紅

福建省醫學科學研究院 福建省醫學測試重點實驗室，福建福州 350001

黃酮類化合物是植物在長期的進化過程中為適應生態環境或抵御外界侵襲而形成的一大類次生代謝產物，在長期的生態適應過程中發揮重要作用。查爾酮異構酶（chalcone-flavonoid isomerase，CFI）能夠催化查爾酮分子內環化反應，生成（2s）-黃烷酮，是植物體內催化黃酮類成分生物合成的第二個關鍵酶，CFI基因表達量與黃酮合成量密切相關[1]。

有關CFI研究非常廣泛，在山葡萄、草莓、白木香、鹽膚木、光果甘草、紅花、紫丁香等多種植物中都報道了該酶基因序列[2-8]。三葉青來源于葡萄科崖爬藤屬植物三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDiel et Gilg）的干燥全草，是福建、浙江地區傳統習用青草藥[9]，具有清熱解毒、祛風化痰、活血止痛等功效，被稱為天然抗生素?，F代醫學表明三葉青有較強的抗炎、抗病毒、抗腫瘤作用[10-11]。實驗證實三葉青中含大量以異葒草素、葒草素、牡荊素、異牡荊素等系列為主的碳苷黃酮化合物[12]，碳苷黃酮是一類具有更強抗腫瘤活性的化合物[13]，為闡明三葉青中CFI的結構基因信息及其在黃酮生物合成途徑中表達調控機制，本研究基于轉錄組數據的生物信息學，設計篩選出一批與黃酮生物合成相關的關鍵基因，根據轉錄組篩選的多個基因序列設計引物，進行反轉錄PCR，獲得多個產物，經過克隆及測序，首次成功鑒定出1條與其他植物中查爾酮-異構酶具有高度同源序列的三葉青CFI。為后期利用基因工程菌株干預誘導CFI基因增加碳苷黃酮化合物的合成量，從而進一步增強三葉青抗腫瘤活性奠定基礎。

1 材料

三葉青藥材采自福州集珍園生物科技有限公司寧化縣水茜鎮三葉青種植基地，選擇主要優選品種閩選1號（MX1），經福建省醫學科學研究院劉洪旭研究員鑒定為葡萄科植物三葉崖爬藤（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg）。新 鮮 葉 片及時用液氮在研缽中充分研磨后帶回實驗室保存在-80℃冰箱中用于提取總RNA。

植物總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑、PCR試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，克隆載體pMD18-T及大腸桿菌DH5a購自大連寶生物科技有限公司。轉錄組測序由上海美吉生物科技有限公司完成，引物的合成和產物測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

2 方法

2.1 轉錄組測序及數據分析

三葉青樣品用干冰送至上海美吉生物科技有限公司進行轉錄組測序。基于課題組前期研究結果和轉錄組數據分析三葉青轉錄組測序數據，提取到CFI的相關序列。

2.2 三葉青總 RNA提取及逆轉錄PCR

取三葉青樣品，液氮中充分研磨后，按植物總RNA提取試劑盒說明進行操作。以所提的總RNA為模板，以oligo（dT16）及隨機引物（N8）作為引物進行逆轉錄反應。以逆轉錄產物為模板，使用正向引物CFI-F（5’-CCTTTCTCTGCATCAGTTTCCC-3’）與反向引物CFI-R（5’CACCATAAAAGTCAATACTCTCCC-3’）進行PCR，擴增片段CFI-ORF。

2.3 分子克隆及測序

將CFI的PCR擴增產物經回收純化后與克隆載體pMD18-T連接并轉化至大腸桿菌DH5a。篩選的陽性克隆菌送至上海生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

2.4 MX1-CFI開放閱讀框序列分析及基于氨基酸序列的系統發育分析

使用BioEdit軟件對根據MX1-CFI的開放閱讀進行氨基酸翻譯；使用PhyloSuite 2.1[14]中的MAFFT算法對13個植物CFI基因的氨基酸序列進行多重序列比對并通過在服務器Esprit 3.0（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）進行美化；系統發育分析采用最大似然法（maximum likelihood，ML）進行，用于系統發育分析的數據集最適進化模型使用ModelFinder[15]基于BIC標準進行，模型為JTTDCMut+G4，各分支的可靠性根據10 000次超快自舉法（ultrafast bootstrapping）進行評估。

3 結果與生物信息學分析

3.1 CFI基因擴增及測序

使用正向引物CFI-F與反向引物CFI-R對反轉錄產物進行PCR，擴增獲得MX-CFI片段。瓊脂糖凝膠電泳圖（圖1）顯示，PCR產物的長度與轉錄組分析的數據相符。測序結果經過NCBI數據庫BLAST搜索比對分析，確認該擴增產物為具有完整ORF框的CFI基因，其序列長度為714 bp，編碼237個氨基酸（圖2）。NCBI登錄號為OP358477。

圖1 三葉青PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳

圖2 根據遺傳密碼子分析的MX1-CFI氨基酸序列

3.2 三葉青CFI同源氨基酸序列比對及二維結構分析

通過NCBI數據庫獲取12個與MX-CFI氨基酸序列高度同源的其他植物CFI。使用軟件MEGA[16]及Esprit 3.0（https://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）進行多重序列比對與修飾。分析顯示，13個CFI均能形成緊密的二維結構，含有多達89個氨基酸參與形成7個α螺旋；多達60個氨基酸參與形成11個β折疊（圖3）。高度保守的氨基酸序列與高密度二維結構可能是該基因產物執行查爾酮異構酶功能的必需特征。

圖3 包含三葉青MX1-CFI在內的13個植物CFI的氨基酸序列多重比對

3.3 基于CFI同源氨基酸序列同源性的系統進化分析

基于CFI基因重建的系統發育樹（圖4）所示，13個植物的CFI基因在進化上可以聚為兩大簇，其中三葉青優先與大齒牛果藤（GenBank 登錄號KC753776）相聚成簇，隨后與山葡萄（GenBank登 錄 號KT314072）、河 岸 葡 萄（GenBank 登 錄 號XP034703680）、釀酒葡萄（GenBank 登錄號RVX13902）和唇葡萄（GenBank 登錄號ACS36662）聚為一大簇，其他7種植物聚為另一大簇，表明三葉青的CFI基因在進化上與大齒牛果藤的親緣關系最近。

圖4 13個植物CFI的系統發育樹

4 討論

本研究中的三葉青中查爾酮異構酶生物學信息可為研究三葉青CFI在黃酮類生物合成過程中的重要性提供參考。例如，三葉青的多個品種間是否也在CFI的氨基酸序列與基因表達量上存在差異，CFI氨基酸序列差異明顯的三葉青品種內黃酮含量是否存在明顯差異，CFI表達量在時空上的變化能否作為三葉青黃酮積累的標記特征。還可通過比較三葉青多個品種的黃酮含量與CFI氨基酸序列差異間的相關性，建立類似于條形碼的分子標記來區分三葉青品種間的遺傳進化關系，以評估三葉青品種的藥用價值。

目前三葉青藥用部位主要還是地下塊根[17-18]，塊根生長周期較長，作為藤本植物，三葉青地上部分產量較高，有較高的經濟價值，而黃酮主要存在葉片中，因此對三葉青CFI基因信息的分析，可為今后通過生物技術進一步提高黃酮類功效物質在三葉青葉中的量奠定了基礎。

系統發育分析采用ML法，進化生物學認為，在進化模型確定的情況下，ML法是與進化事實吻合最好的建樹算法[19]。三葉青與大齒牛果藤均屬于葡萄科崖爬藤屬藤本植物，山葡萄、河岸葡萄、釀酒葡萄和唇葡萄則屬于葡萄科葡萄屬藤本植物，基于ML法重建的系統發育樹顯示CFI基因在進化上具有較強的寄主特異性，分析結果與植物自身形態差異及植物分類學是相一致，說明CFI基因在植物遺傳進化過程中具有一定的保守性與標記性。因此，CFI可以作為一種特異性基因來描述不同植物間的差異，是植物多樣性的一種分子標記。

本研究存在一定客觀的局限性，CFI基因是黃酮類成分合成的上游基因，三葉青中黃酮的合成過程多個關鍵基因特別是形成碳苷黃酮的關鍵基因如糖基轉移酶、加氧酶、羥化酶等還待挖掘驗證，碳苷黃酮累積量與哪些關鍵基因密切相關都還需要進一步深入研究。在今后的研究中，可結合黃酮含量及各基因表達量，找出其中關聯密切的基因，為今后活性成分合成及調控機制研究提供更全面信息。