高效液相色譜法同時測定阿司匹林片中阿司匹林和水楊酸含量

趙 勇 鄭金鳳 劉雁鳴 張 悅

湖南省藥品檢驗檢測研究院 國家藥品監督管理局藥用輔料工程技術研究重點實驗室，湖南長沙 410006

阿司匹林（乙酰水楊酸）作為一種經典的非甾體抗炎藥，是臨床上常用的解熱、鎮痛藥物[1-2]。其生產過程中乙?；煌耆蛸A藏過程中發生水解，均會產生游離水楊酸，水楊酸在空氣中會被氧化成一系列醌型有色物質，影響產品的外觀。同時水楊酸對腸胃有很大的刺激，逾量會產生中毒現象[3-4]?！吨腥A人民共和國藥典》收載的阿司匹林藥物，其質量標準中均規定了阿司匹林的含量測定，以及游離水楊酸的測定[5]。有研究指出該方法雖能準確測定兩者含量，但采用的水-甲醇的流動相體系中測定的阿司匹林和水楊酸的分離度不佳，存在一定程度的水解現象，使水楊酸的測量值比實際值偏大，并且采用甲醇處理樣品易揮發，增大誤差的產生[6-8]。因此，在《中華人民共和國藥典》阿司匹林片游離水楊酸和含量測定項目的基礎上，本研究對色譜條件進行了優化，修改了流動相，修訂了供試品溶液的配制方法，建立了同時測定阿司匹林片中阿司匹林和水楊酸含量的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），為阿司匹林類藥物質量標準制訂提供依據。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Waters e2695型高效液相色譜儀（沃特世公司），Shimadzu LC-20A高效液相色譜儀（島津公司），瑞士 Mettler-Toledo公司MS105DU 電子天平，精度為十萬分之一。

1.2 試劑

阿司匹林對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100113-201706，純度：99.8%）；水楊酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100106-201303，純度：99.9%）；乙腈（德國CNW Technologies GmbH公司，批號：E5450210，純度≥99.9%）；阿司匹林片（廣東九明制藥有限公司，國藥準字H44020839，規格：0.3 g，批 號：20211014、20211015、20212201）；阿司匹林片（山西太原藥業有限公司，國藥準字H14022112，規 格：0.3 g，批 號：220901、221207、221405）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫25℃；紫外檢測波長：237 nm；流動相為磷酸∶乙腈∶水=2∶400∶600（v/v/v）；流速：1 ml/min；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的配制

供試品溶液：取本品20片，精密稱定，充分研細，精密稱取細粉適量（約相當于阿司匹林10 mg），置100 ml量瓶中，加乙腈溶解后稀釋至刻度，搖勻，濾膜濾過，取續濾液即得。

阿司匹林對照品溶液：精密稱取對照品適量，用乙腈溶解并稀釋成2 mg/ml的溶液，作為標準儲備液。再分別精密量取適量標準儲備液，用乙腈配制成10、50、100、200、500 μg/ml的系列對照品溶液。

水楊酸對照品溶液：精密稱取對照品適量，用乙腈溶解并稀釋成1 mg/ml的溶液，作為標準儲備液。再分別精密量取適量標準儲備液，用乙腈配制成2、5、10、20、50 μg/ml的系列對照品溶液。

空白溶液：乙腈溶液。

2.3 系統適用性試驗

精密吸取上述空白溶液、對照品溶液及供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結果見圖1，空白無干擾，理論板數按水楊酸計算不低于4000，水楊酸與阿司匹林間的分離度符合要求。

圖1 系統適應性色譜圖

2.4 線性關系、檢測限與定量限

分別精密量取阿司匹林、水楊酸系列對照品溶液，進樣，記錄色譜圖。以阿司匹林、水楊酸濃度為橫坐標（X，μg/ml），以峰面積為縱坐標（Y），得回歸方程：阿司匹林為Y=5481X-24.15，r=0.9998；水楊酸為Y=6542X+19.74，r=0.9999。結果表明，阿司匹林在10～500 μg/ml，水楊酸在2～50 μg/ml的濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。采用信噪比法，按最小檢測限要求S/N≈3計算檢測限，阿司匹林檢測限為1.54 μg/ml；水楊酸檢測限為0.22 μg/ml。按最小定量限要求S/N≈10計算定量限，阿司匹林定量限為5.13 μg/ml；水楊酸定量限為0.73 μg/ml。

2.5 精密度試驗

取阿司匹林、水楊酸對照品溶液，連續進樣6次。結果阿司匹林、水楊酸峰面積RSD分別為0.74%、0.94%（n=6），說明儀器精密度較好。

2.6 重復性試驗

取同一批樣品（批號：20211014）按“2.2溶液的制備”平行制備6份供試品溶液，依法測定。結果樣品中阿司匹林平均含量為99.9%，RSD為0.74%（n=6）；水楊酸平均含量為0.12%，RSD為1.2%（n=6），說明本方法重復性好。

2.7 穩定性試驗

取樣品（批號：20211014）按“2.2溶液的制備”制備供試品溶液一份，分別于0、4、8 h進樣，記錄峰面積。結果表明：供試品溶液放置8 h，阿司匹林、水楊酸峰面積RSD分別0.87%、1.25%（n=6），說明供試品溶液放置8 h內較穩定。

2.8 回收率試驗

取樣品（批號：20211014），共6份，精密加入定量阿司匹林、水楊酸對照品。按“2.2溶液的制備”制備供試品溶液，測定并計算回收率。結果阿司匹林平均回收率為100.04%，RSD為0.54%（n=6）；水楊酸平均回收率為98.47%，RSD為0.97%（n=6）。

2.9 耐受性試驗

考察不同品牌色譜儀及色譜柱，對阿司匹林、水楊酸測定結果的影響。結果顯示，在上述色譜條件下阿司匹林、水楊酸峰均可有效分離，阿司匹林、水楊酸峰測定結果RSD分別為0.07%、2.78%（n=2），見表1，說明本法耐用性較好。

表1 耐受性試驗結果（批號：20211014）

2.10 樣品測定

樣品測定結果均符合規定（《中華人民共和國藥典》標準規定，水楊酸：不得過阿司匹林標示量的0.3%；阿司匹林：應為標示量的95.0%～105.0%），見表2。

表2 樣品測定結果

3 討論

3.1 流動相的選擇

阿司匹林是一種水解性極強的藥物，《中華人民共和國藥典》中以水-甲醇流動相檢測時存在一定程度的水解現象，使得水楊酸的測量值比實際值偏大。另國家藥品監督管理局國家藥品標準WS1-（X-048）-2005Z 阿司匹林緩釋片中采用乙腈-四氫呋喃-冰醋酸-水（23∶5∶5∶61）為流動相檢測游離水楊酸，四氫呋喃對環境不友好，故本研究選擇乙腈-水系統為流動相[9]。

阿司匹林在堿性條件易水解，且水解程度與溶液pH值有關，選擇實驗常用的磷酸為pH調節劑，考察乙腈∶水不同比例[300∶700、400∶600、500∶500、600∶400（v/v）]下 磷 酸 加 入 量 對阿司匹林與水楊酸的分離情況及阿司匹林的穩定性的影響[10-11]。結果顯示，當磷酸∶乙腈∶水=2∶400∶600（v/v/v）混合體系作為流動相，流動相pH值為2.3，阿司匹林與水楊酸能完全分離，且阿司匹林在8 h內穩定性較好。

3.2 樣品的前處理

稱取4份等質量的阿司匹林，分別用1%冰醋酸的甲醇溶液（《中華人民共和國藥典》中采用）、甲醇溶液、乙腈溶液、磷酸∶乙腈∶水=2∶400∶600（v/v/v）混合液制備供試品溶液[12-15]，分別放置0、24 h，進樣，記錄色譜圖。結果：在0 h時，各溶劑制備的供試品溶液中阿司匹林峰面積無差異，且基本無水楊酸峰；放置24 h后，均出現水楊酸峰，乙腈制備的供試品溶液中水楊酸峰面積最小。這表明阿司匹林乙腈中的水解速度較慢，故選擇乙腈溶解樣品。

3.3 檢測波長的選擇

配制濃度為50 μg/ml的阿司匹林、水楊酸對照品溶液，在190～400 nm范圍內掃描，記錄阿司匹林、水楊酸紫外吸收曲線。結果顯示，阿司匹林在310、276、229、197 nm處有較大吸收，水楊酸在202、237、305 nm處有較大吸收。水楊酸在202、237 nm處吸收強度遠遠大于305 nm處，阿司匹林在276、229、197 nm處吸收強度遠遠大于310 nm處，見圖2?？紤]200 nm附近為溶劑末端吸收波長，故237 nm可作為水楊酸的檢測波長。另阿司匹林在阿司匹林類藥物中為主要有效成分，且在237 nm附近也有較高吸收，故最終選擇237 nm為檢測波長。

圖2 阿司匹林和水楊酸紫外吸收曲線

3.4 柱溫的選擇

本研究考察了不同柱溫（20、25、30、35℃）條件下各組分的分離及響應情況。結果發現，當柱溫≥25℃時，阿司匹林和水楊酸均有較好的分離及響應?？紤]溫度過高可能會加速阿司匹林水解，故選擇25℃柱溫條件。

3.5 方法比較

采用《中華人民共和國藥典》阿司匹林片質量標準下游離水楊酸、含量測定項測定阿司匹林、水楊酸含量（批號：20211014、20211015、20212201），3批阿司匹林含量分別為99.7%、99.6%、99.6%，水楊酸含量分別為0.13%、0.14%、0.13%；經比較兩種方法結果一致。

綜上所述，本研究建立的高效液相色譜法，采用乙腈直接溶解樣品，同時測定阿司匹林片中阿司匹林和水楊酸含量。該方法較《中華人民共和國藥典》方法比較，操作更簡便，能很好分離阿司匹林和水楊酸，并準確測定其含量，與藥典方法比較結果一致。