電位滴定法測(cè)定環(huán)絲氨酸的含量

劉靜蘭

廈門市食品藥品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，福建廈門 361012

環(huán)絲氨酸是治療耐藥結(jié)核病的核心藥物，近年來該藥物在臨床治療上得到了廣泛應(yīng)用[1-5]，結(jié)構(gòu)式如圖1。當(dāng)前，國內(nèi)無環(huán)絲氨酸現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，僅《美國藥典》[6]《日本藥典》[7]和《國際藥典》[8]有收載。其中，《國際藥典》采用人工酸堿滴定法，其指示劑終點(diǎn)變色不靈敏，個(gè)人主觀因素會(huì)產(chǎn)生終點(diǎn)判斷的誤差。按國家藥品標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)原則，原料藥的含量測(cè)定首選容量分析法。基于文獻(xiàn)參考[9-15]，本研究建立了用氫氧化鈉滴定液測(cè)定環(huán)絲氨酸含量的電位滴定法，以水為溶劑并加入適量鹽酸溶液來區(qū)分強(qiáng)酸弱酸的滴定，電位滴定曲線有兩個(gè)明顯的突躍點(diǎn)，空白校正和滴定結(jié)果易于識(shí)別判斷，且與《國際藥典》的測(cè)定結(jié)果比較無顯著性差異。

圖1 環(huán)絲氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)圖

1 儀器與試藥

T5電位滴定儀，配備InMotion Flex Autosampler全自動(dòng)進(jìn)樣器（梅特勒-托利多）；DGi111-SC復(fù)合玻璃pH電極（梅特勒-托利多）；XS-105分析天平（梅特勒-托利多）；S220 pH計(jì)（梅特勒-托利多）。

環(huán) 絲 氨 酸 對(duì) 照 品（Sigma-Aldrich，批 號(hào)：CCYF210044，純度99.8%）；環(huán)絲氨酸（A廠，批號(hào)：CCYF210035、CCYF210036、CCYF210037；B廠，批號(hào)：200026、200027、200028）；氫氧化鈉滴定液（F=0.1004，批號(hào)：F0022768，Bepure）；鹽酸為AR級(jí)分析純（批號(hào)：20170323，滬試）；異丙醇為色譜純（批 號(hào)：K52449740025，Sigma-Aldrich）；水 由Milli-Q系統(tǒng)制的超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶劑的選擇

根據(jù)《中華人民共和國藥典》凡例中溶解度試驗(yàn)法，測(cè)得環(huán)絲氨酸在水中易溶，在甲醇中微溶，在乙醇和異丙醇中極微溶解。環(huán)絲氨酸水溶液pH為5.5～6.5[8]，具有酸堿兩性，可與酸或堿成鹽，故選擇以水為溶劑。考慮到電位滴定儀的裝置和滴定杯容量的操作要求，水溶劑選取30 ml。

分別取環(huán)絲氨酸約0.1 g（批號(hào)：CCYF210037和200028），加30 ml水使溶解后測(cè)定pH值，結(jié)果分別為6.05和6.12。

2.2 自動(dòng)電位滴定儀條件

采用Mettler DGi111-SC復(fù)合玻璃pH電極；參數(shù)設(shè)置：滴定劑添加：動(dòng)態(tài)添加模式；dE（設(shè)定值）：8.0；dV（最小值）：0.001 ml；dV（最大值）：0.2 ml；滴定模式：平衡控制模式；閾值（判斷滴定是否達(dá)到終點(diǎn)的參數(shù)，是 dE與dV的比值。）：0.5，附加EQP標(biāo)準(zhǔn)：最陡突躍；EQP的數(shù)量：2。

2.3 測(cè)定方法

取環(huán)絲氨酸約0.1 g，精密稱定，加30 ml水使溶解后，加20 ml鹽酸溶液（0.01 mol/L），搖勻，采用電位滴定法，用氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）滴定，以兩個(gè)突躍點(diǎn)體積的差作為滴定體積，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 ml氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）相當(dāng)于10.21 mg的環(huán)絲氨酸。記錄E-V曲線和dE/dV-V曲線，其中dE/dV-V曲線最高點(diǎn)（突躍點(diǎn)）對(duì)應(yīng)于滴定終點(diǎn)時(shí)消耗滴定劑的體積。典型電位滴定圖見圖2。

圖2 環(huán)絲氨酸電位滴定曲線圖

2.4 空白試驗(yàn)

取水30 ml為溶劑，在滴定前加入20 ml鹽酸溶液（0.01 mol/L），照“2.2”項(xiàng)下方法滴定，結(jié)果見圖3。空白溶劑電位滴定曲線平滑且清晰可辨，呈現(xiàn)兩個(gè)突躍點(diǎn)，測(cè)得的兩點(diǎn)體積差為0.022 ml。

圖3 空白溶劑電位滴定曲線

2.5 鹽酸溶液加入量的考察

精密稱取環(huán)絲氨酸（批號(hào)：CCYF210037和200028）各約0.1 g，分別置于滴定杯中，溶劑總體積不變的條件下，考察鹽酸溶液（0.01 mol/L）加入5、20、50 ml對(duì)樣品溶液pH值和含量測(cè)定結(jié)果的影響，結(jié)果見表1。由圖4電位滴定曲線圖結(jié)果可知，當(dāng)鹽酸溶液加入量從5 ml增加至20 ml時(shí)，第一個(gè)突躍點(diǎn)曲線更加尖銳也更易識(shí)別。但是，當(dāng)鹽酸溶液加入量增加至50 ml時(shí)，第一個(gè)突躍點(diǎn)曲線變化卻并未明顯改善，反而會(huì)造成滴定液的消耗。因此，綜合考慮選取鹽酸溶液（0.01 mol/L）加入量20 ml較為適宜。

表1 鹽酸溶液（0.01mol/L）加入量對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響

圖4 不同鹽酸溶液（0.01 mol/L）加入量的電位滴定曲線（批號(hào)：CCYF210037）

2.6 線性關(guān)系考察

分別精密稱取環(huán)絲氨酸（批號(hào)：CCYF210037）0.020 58、0.049 51、0.1044、0.1503、0.2017和0.2512 g置于滴定杯中，按“2.3”項(xiàng)下方法制備成相當(dāng)于原濃度20%、50%、100%、150%、200%和250%的系列濃度，并按“2.2”項(xiàng)下滴定條件設(shè)定進(jìn)樣序列依次自動(dòng)電位滴定。以各樣品所消耗氫氧化鈉滴定液的兩點(diǎn)體積差（Y）對(duì)稱樣量（X）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=96.281X+0.0964（r=1.0000）。結(jié)果表明環(huán)絲氨酸在0.020 58～0.2512 g內(nèi)與兩個(gè)突躍點(diǎn)的體積差呈現(xiàn)線性關(guān)系良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密稱取環(huán)絲氨酸（批號(hào)：CCYF210037）6份各約0.1 g，分別置于滴定杯中，加30 ml水使溶解，加20 ml鹽酸溶液（0.01 mol/L），搖勻，于室溫下放置0、4、8、16和24 h后，照“2.2”項(xiàng)下滴定條件進(jìn)行電位滴定測(cè)定其含量。結(jié)果平均含量99.67%，RSD為0.6%，表明在24 h內(nèi)測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批環(huán)絲氨酸（批號(hào)：CCYF210037）6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，照“2.2”項(xiàng)下電位滴定條件測(cè)定并計(jì)算含量。結(jié)果平均含量99.88%，RSD為0.3%，表明自動(dòng)電位滴定方法的精密度高，重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的同一批環(huán)絲氨酸樣品9份（批號(hào)：CCYF210037，含量99.88%），每份約0.05 g（樣品含量減半），精密稱定，分別加入環(huán)絲氨酸對(duì)照品40、50、60 mg（分別相當(dāng)于樣品測(cè)定濃度的80%、100%和120%），按“2.2”和“2.3”項(xiàng)下方法測(cè)定環(huán)絲氨酸含量并計(jì)算其回收率。環(huán)絲氨酸低、中、高濃度回收率分別為99.69%、99.45%、99.63%，平均回收率為99.59%，RSD為0.6%，由表2結(jié)果表明其回收率良好。

表2 回收率結(jié)果

2.10 國際藥典方法

取環(huán)絲氨酸約0.1 g，精密稱定，加水5 ml使溶解后，加異丙醇75 ml，用氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）滴定，用麝香草酚酞指示液指示終點(diǎn)，并將滴定的結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。每1 ml氫氧化鈉滴定液（0.1 mol/L）相當(dāng)于10.21 mg的環(huán)絲氨酸。

2.11 樣品的測(cè)定

取環(huán)絲氨酸樣品6批，精密稱定，分別按“2.3”和“2.10”項(xiàng)下方法測(cè)定并計(jì)算環(huán)絲氨酸含量，結(jié)果見表3，兩種測(cè)定方法結(jié)果無顯著性差異。

表3 兩種測(cè)定方法比較

3 討論

3.1 人工滴定法

《國際藥典》收載的人工滴定方法采用麝香草酚酞為指示劑，其變色范圍是pH 9.3～10.5（無色變藍(lán)色），實(shí)際滴定的終點(diǎn)顏色為無色變接近透明的淺藍(lán)色，顏色變化不明顯，肉眼不易辨認(rèn)。而空白校正消耗的滴定液體積過小，滴定管讀數(shù)的準(zhǔn)確度和目視判斷等主客觀因素會(huì)導(dǎo)致一定的誤差。此外，在試驗(yàn)中還考察過僅以水為溶劑，不添加異丙醇的條件下進(jìn)行滴定，結(jié)果其終點(diǎn)顯色反而更為明顯，但空白校正所需滴定液也更加少量，故有待進(jìn)一步優(yōu)化滴定方法。

3.2 電位滴定法

3.2.1 以水/異丙醇為溶劑 鑒于《國際藥典》滴定方法終點(diǎn)不易判斷的問題，故選擇以電位滴定的方法來判斷終點(diǎn)。以水/異丙醇為溶劑，在不添加指示劑的條件下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果空白校正的電位曲線呈現(xiàn)折線狀，dE/dV-V曲線有兩個(gè)突躍點(diǎn)且重現(xiàn)性很差。而在樣品的滴定過程中也識(shí)別出兩個(gè)不規(guī)則狀的突躍點(diǎn)，第一個(gè)突躍點(diǎn)pH約為7.8，第二個(gè)突躍的pH值為11.5～12.0，與麝香草酚酞的變色范圍并不一致。這也證實(shí)了藥典方法終點(diǎn)不易判斷的問題。

3.2.2 以水為溶劑 僅以水溶劑，考慮到水中溶解極少量的碳酸會(huì)與氫氧化鈉滴定液進(jìn)行反應(yīng)，故需要做空白校正。本試驗(yàn)采用Milli-Q超純水，結(jié)果空白滴定識(shí)別的EQP終點(diǎn)體積約為0.02 ml。由于滴定儀精度有限，dE/dV-V曲線呈負(fù)向趨勢(shì)，未識(shí)別與碳酸反應(yīng)的突躍點(diǎn)。而樣品的滴定曲線僅呈現(xiàn)一個(gè)突躍點(diǎn)，pH約為9.9，呈正向趨勢(shì)。

3.2.3 以水/鹽酸為溶劑 以水/鹽酸為溶劑，在空白校正中氫氧化鈉滴定液先與鹽酸反應(yīng)形成第一個(gè)突躍點(diǎn)（pH約為5.2），然后跟水中含有的碳酸反應(yīng)形成第二個(gè)突躍點(diǎn)（pH約為7.5）。通過兩個(gè)突躍點(diǎn)的體積差來測(cè)得碳酸含量，結(jié)果重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確性更高。

在樣品試驗(yàn)中，滴定前鹽酸溶液的加入先與環(huán)絲氨酸中的氨基反應(yīng)生成鹽酸鹽，區(qū)分水中剩余游離的鹽酸以及碳酸，使得強(qiáng)酸突躍更加明顯易識(shí)別，作為區(qū)分弱酸滴定的起點(diǎn)。因此，氫氧化鈉滴定液先和剩余游離的鹽酸反應(yīng)形成第一個(gè)突躍點(diǎn)（pH約為6.0），然后與水中的碳酸和環(huán)絲氨酸反應(yīng)形成第二個(gè)突躍點(diǎn)（pH約為10.0）。通過空白校正排除碳酸的干擾，從而測(cè)得準(zhǔn)確的環(huán)絲氨酸含量。

3.2.4 滴定劑 無論是人工滴定法還是電位滴定法，避免試驗(yàn)中二氧化碳消耗氫氧化鈉滴定液產(chǎn)生的終點(diǎn)誤差是關(guān)鍵點(diǎn)。除了空白校正，滴定液也不宜放置過久，會(huì)吸收更多的二氧化碳造成滴定結(jié)果偏大，故氫氧化鈉滴定液最好臨用前標(biāo)定。

綜上所述，相對(duì)于人工指示劑滴定法，電位滴定法的精密度更優(yōu)，準(zhǔn)確度更好，自動(dòng)化程度高，能夠提高實(shí)驗(yàn)效率，避免人為誤差。本方法操作簡(jiǎn)便、測(cè)定快速、重復(fù)性好且綠色環(huán)保，適用于環(huán)絲氨酸原料藥的含量測(cè)定。