不同菌種對蠶豆醬前期發(fā)酵的影響

李婷

（1.甘肅省農業(yè)科學院農業(yè)質量標準與檢測技術研究所，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省農業(yè)科學院畜草與綠色農業(yè)研究所，甘肅蘭州 730070）

我國傳統發(fā)酵豆制品歷史源遠流長，形成了種類多樣且兼具地方特色的醬類調味品[1]。其中傳統釀造的蠶豆醬是以去殼蠶豆為主要原料，經蒸煮、制曲、曬露、發(fā)酵等工序，并輔以辣椒醬、香油等輔料制成的半流動狀態(tài)的一類調味食品[1-2]。蠶豆醬呈醬紅色或醬褐色，色澤鮮亮，鮮美可口，細膩無渣，具有代菜佐餐、助消化功能，深受消費者喜愛[3-4]。蠶豆瓣作為蠶豆醬的原料，不僅含有豐富的蛋白質、糖類及人體所必需的氨基酸和礦物元素，且有抑制肝臟脂肪堆積、去除放射性物質、抑制血清膽固醇升高、抗氧化作用等多種生理功能[5-7]。蠶豆醬目前在國內外市場上的生產雖已形成標準化，但我國傳統蠶豆醬生產主要以自然發(fā)酵為主，此法的制曲是在自然條件下進行的，利用自然環(huán)境中的微生物共同消耗原料進行生長代謝，通過曬露發(fā)酵、后熟等工序后形成了蠶豆醬獨特的色香味[2]。自然發(fā)酵的蠶豆醬風味豐富，但存在生產周期長、生產效率低、衛(wèi)生條件差、產品質量不穩(wěn)定等缺點[8]。為解決目前蠶豆醬生產存在的問題，近年來，許多研究學者在豆醬蒸煮技術[9]、制曲技藝[8-10]、縮短生產周期[10-11]、發(fā)酵技術[12-13]等方面進行了大量試驗。眾多學者的研究表明：蠶豆醬發(fā)酵后期以酵母發(fā)酵為主，是形成特有色香味的時期。然而并沒有針對蠶豆醬前期發(fā)酵的優(yōu)勢菌種的研究，蠶豆醬前期發(fā)酵是影響蠶豆醬品質的重要時期，找到適于蠶豆醬前期發(fā)酵的優(yōu)勢菌種，對縮短蠶豆醬生產周期、固定蠶豆醬發(fā)酵菌種以及提高蠶豆醬品質具有重要意義。

本研究主要利用米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、毛霉（Mucor）、酵母菌（yeast）4 種單一菌種純種制曲發(fā)酵制作蠶豆醬，分析其前期發(fā)酵過程中醬醅中的總酸、氨基酸態(tài)氮含量、醬色差異等指標的變化，旨在研究不同菌種對蠶豆醬前期發(fā)酵品質形成的影響，篩選出適于蠶豆醬前期發(fā)酵的優(yōu)勢菌種，對豐富蠶豆醬的風味、提高蠶豆醬的品質具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶豆、面粉、酵母、食鹽：市售；米曲霉（滬釀3.042）、黑曲霉（AS3.350）：上海佳民釀造食品有限公司；毛霉菌種：成都市調味品研究所。

氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醛：天津市大茂化學試劑廠；乙醇：天津市富寧精細化工有限公司；鄰苯二甲酸氫鉀、酚酞：上海中秦化學試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GNP-9160 恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9146A 恒溫干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；AR224CN 電子天平：奧豪斯儀器（常州）有限公司；L7 可見分光光度計、MJ-250F-1 霉菌培養(yǎng)箱：上海儀電分析儀器有限公司；TD52離心機：湖南凱達科學儀器有限公司；SG2pH 計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蠶豆醬的制備

1.3.1.1 工藝流程

蠶豆醬的制備工藝流程如下[14]。

1.3.1.2 操作要點

1）去皮蠶豆：將蠶豆在105 ℃條件下烘烤1.5～2.0 h 至呈熟而不爛的狀態(tài)[15]，以除去蠶豆中的雜菌和水分，有利于霉菌的生長[16]。

2）面粉處理：將面粉置于105 ℃烘箱內烘烤1.5～2.0 h，以除去面粉中的雜菌和水分，方便進一步吸收蠶豆中的多余水分，促進霉菌的生長[16]。

3）前期發(fā)酵：將蒸煮干燥好的蠶豆和烘烤好的面粉混合均勻，按照曲料（蠶豆＋面粉）的0.3%分別接入米曲霉、黑曲霉、毛霉的麩曲菌種在不同溫度下培養(yǎng)，米曲霉、黑曲霉于30 ℃下培養(yǎng)48 h，毛霉于20 ℃下培養(yǎng)60 h，酵母于28 ℃培養(yǎng)60 h，制備曲坯[15]。

4）后期保溫發(fā)酵：由4 種單一菌種制得的曲坯，按照曲坯與鹽水質量比1 ∶1 的比例添加質量分數為10%的鹽水，入壇后于40 ℃下保溫發(fā)酵[15]。

1.3.1.3 蠶豆醬的制作工藝

稱取100 g 去皮蠶豆，進行蒸熟滅菌，加入20%（20 g）面粉攪拌均勻，再分別加入0.3%（0.36 g）米曲霉、黑曲霉、毛霉、酵母制備曲坯。按照1.3.1.2 步驟4）進行保溫發(fā)酵。

對比分析不同菌種發(fā)酵初期（1、3、5、7 d）對蠶豆醬氨基酸態(tài)氮含量、總酸含量和醬色差異的影響。

1.3.2 氨基酸態(tài)氮測定

采用GB 5009.235—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸態(tài)氮的測定》[17]進行測定。

1.3.3 總酸含量測定

采用GB 12456—2021《食品安全國家標準食品中總酸的測定》[18]進行測定。

1.3.4 醬色差異分析

分別稱取5 g 蠶豆醬發(fā)酵1、3、5、7 d 的醬醅樣品，加入25 mL 磷酸緩沖液勻漿，2 000 r/min 離心10 min，取上清液于波長420 nm 處進行比色，以磷酸緩沖液為空白[2]。

1.3.5 蠶豆醬的品質評價

通過上述試驗得到適于蠶豆醬發(fā)酵的優(yōu)勢菌種，對該優(yōu)勢菌種進行驗證性試驗。參照1.3.1.3 的方法制備優(yōu)勢菌種的曲坯，并按照同樣的比例添加鹽水，在40 ℃下保溫發(fā)酵30 d 得到成品蠶豆醬。對成品蠶豆醬進行總酸、氨基酸態(tài)氮含量的測定以及感官評價。

1.3.6 感官評價

按照色澤、氣味、口感、組織特性4 項感官指標對蠶豆醬成品進行感官評價，總分100 分，具體感官評分標準見表1[8]。

表1 蠶豆醬感官評分指標Table 1 Sensory score index of broad bean paste

1.4 數據處理

每組試驗平行重復3 次，以平均值±標準差表示；采用Excel 2016、OriginPro 2021 對試驗數據進行繪制對比。

2 結果與分析

2.1 不同菌種對蠶豆醬發(fā)酵前期總酸含量的影響

總酸包括有機酸及無機酸，是衡量豆瓣醬質量的重要指標，能賦予豆醬輕柔、清爽的感官特征[19]。國家標準規(guī)定，醬產品中總酸含量不得超過2.0 g/100 g（以乳酸計）[20]。4 種不同菌種發(fā)酵蠶豆醬前期所測得的總酸含量見圖1。

圖1 不同菌種發(fā)酵后蠶豆醬中總酸含量的變化Fig.1 Changes of total acid content in broad bean paste after fermentation with different strains

由圖1 可知，隨著蠶豆醬前期發(fā)酵時間的延長，4 種菌種發(fā)酵后蠶豆醬的醬醅中總酸含量呈增大趨勢，發(fā)酵第1 天，酵母制曲發(fā)酵前期醬醅中所測得的總酸含量最高，為1.623 g/100 g，毛霉較高，為1.532 g/100 g，黑曲霉次之，為1.245 g/100 g，米曲霉最少，為0.764 g/100 g；發(fā)酵第3 天，毛霉、酵母發(fā)酵制曲產生的總酸含量相對較高，分別為2.649、2.589 g/100 g，而由米曲霉制曲發(fā)酵產生的總酸含量最低，為1.489 g/100 g；發(fā)酵第5 天，毛霉制曲發(fā)酵產生的總酸含量最高，為2.680 g/100 g，米曲霉制曲發(fā)酵產生的總酸含量最低，為1.511 g/100 g；發(fā)酵第7 天，黑曲霉發(fā)酵產生的總酸含量最高，為2.900 g/100 g，米曲霉制曲發(fā)酵產生的總酸含量最低，為1.805 g/100 g。這可能是因為在發(fā)酵初期醬醅中的微生物生長繁殖迅速，微生物利用蠶豆中的可發(fā)酵性糖代謝產生乳酸等有機酸，使得總酸含量增加[21]。毛霉、酵母發(fā)酵的蠶豆醬前期醬醅中總酸含量增長較快，而米曲霉發(fā)酵的蠶豆醬前期醬醅中總酸含量增長較慢，可能是因為發(fā)酵環(huán)境中微生物代謝產生的乳酸所形成的弱酸性條件對米曲霉的生長繁殖有抑制作用，而對毛霉、酵母的生長繁殖有誘發(fā)作用，使得毛霉和酵母在有氧條件下，分解糖類產生各種有機酸[22]，醬醅中總酸主要來源于微生物利用原料中的碳水化合物產生的酸類物質（如被乳酸菌、醋酸菌利用產生的乳酸）和發(fā)酵環(huán)境的變化導致微生物細胞自溶以及游離氨基酸的積累等[23]。

醬醅中的酸性物質主要為有機酸，是多種風味物質的前體，且其本身也是重要的感官物質，在醬醅風味及口感的形成中起著重要作用，總酸含量常用來反映豆醬生產過程中微生物污染的程度[19]，因此總酸含量過高或者過低對于豆醬制品的品質均有不利影響。由圖1 結合國家標準考慮，酵母、毛霉、黑曲霉發(fā)酵前期的總酸含量均超過2.0 g/100 g，因此，米曲霉發(fā)酵效果最佳。

2.2 不同菌種對蠶豆醬發(fā)酵前期氨基酸態(tài)氮含量的影響

蠶豆醬中蛋白質降解形成的氨基酸態(tài)氮是評判豆醬質量的重要指標，國家標準中規(guī)定了豆醬中氨基酸態(tài)氮含量不得低于0.3 g/100 g[20]。4 種不同菌種發(fā)酵蠶豆醬前期所測得的氨基酸態(tài)氮含量的變化見圖2。

圖2 不同菌種發(fā)酵后蠶豆醬中氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.2 Changes of amino acid nitrogen content in broad bean paste after fermentation by different strains

由圖2 可知，4 種菌種發(fā)酵的蠶豆醬發(fā)酵前期隨著發(fā)酵時間的增長其醬醅中氨基酸態(tài)氮含量均呈上升趨勢。因為氨基酸態(tài)氮來源于蠶豆醬發(fā)酵前期霉菌等微生物分泌的蛋白酶對蛋白質的分解以及醬醅中微生物的自溶。發(fā)酵前期醬醅中各菌種代謝能力強，對氮源的需求量大，誘導菌種產蛋白酶能力不斷增強，其中中性和堿性蛋白酶是生成氨基酸態(tài)氮的主要水解酶系，蛋白酶將原料中的蛋白質大分子物質降解為多肽和氨基酸，致使氨基酸含量積累使得發(fā)酵1～7 d的醬醅中氨基酸態(tài)氮含量隨著發(fā)酵時間的延長而增加[15，24-25]。發(fā)酵第1 天，米曲霉發(fā)酵產生的氨基酸態(tài)氮含量最高，為0.301 g/100 g，其次是酵母，毛霉發(fā)酵產生的氨基酸態(tài)氮含量最少，為0.227 g/100 g；發(fā)酵第3 天，米曲霉發(fā)酵產生的氨基酸態(tài)氮含量最高，為0.425 g/100 g，毛霉最低，為0.343 g/100 g；發(fā)酵第5 天，米曲霉發(fā)酵產生的氨基酸態(tài)氮含量最高，為0.519 g/100 g，黑曲霉最少，為0.406 g/100 g；發(fā)酵第7 天，米曲霉發(fā)酵產生的氨基酸態(tài)氮含量最高，為0.667 g/100 g，毛霉最少，為0.510 g/100 g。發(fā)酵前期，米曲霉發(fā)酵產生的氨基酸態(tài)氮含量最高，其次為酵母，毛霉和黑曲霉發(fā)酵產生的氨基酸態(tài)氮含量相對較低。這是由于米曲霉相比于其他菌種，其產中性和堿性蛋白酶的能力更強，由其發(fā)酵的蠶豆醬產生的氨基酸態(tài)氮含量增長最快且含量較多，其次為酵母和黑曲霉，毛霉最少，這是因為毛霉分解蛋白質的能力最弱，而酵母發(fā)酵時蛋白酶活力旺盛，在鹽水的滲透壓作用下，原料中的可溶性氮和鈉離子發(fā)生快速交換，導致蠶豆醬中氨基酸態(tài)氮增加[26]。因此，米曲霉產氨基酸態(tài)氮含量高，而毛霉產氨基酸態(tài)氮含量相對較低。

氨基酸態(tài)氮是由蠶豆醬中蛋白質降解所形成的，其數值越高，表明菌種對蛋白質的分解能力越強，成品的滋味越鮮美[15]。氨基酸態(tài)氮含量基本上反映了醬醅中游離氨基酸的含量、醬醅的成熟度和醬醅品質[27]。因此，由試驗結果結合國家標準考慮，米曲霉發(fā)酵效果更佳。

2.3 不同菌種對蠶豆醬發(fā)酵前期醬色差異變化的影響

酶促褐變和非酶促褐變反應是導致蠶豆醬色澤變化的主要原因，酶促褐變和非酶促褐變均是經過一系列復雜的化學反應，生成黑色素的反應過程[28]，形成了蠶豆醬獨有的光澤。蠶豆醬的顏色能反映豆醬品質的好壞。4 種不同菌種發(fā)酵蠶豆醬前期發(fā)酵階段醬色差異如圖3所示。

由圖3 可知，隨著蠶豆醬前期發(fā)酵時間的延長，4 種菌種發(fā)酵的蠶豆醬醬色差異呈上升趨勢。這可能是由于蠶豆中的蛋白質降解形成的氨基酸，在好氧條件下，經過酚羥基酶，多酚氧化酶的催化，發(fā)生了一系列復雜的化學變化后，導致黑色素的形成，黑色素在醬醅中隨著發(fā)酵時間的推移而積累的結果。此時，醬賠中黑色素的主要來源是在多酚氧化酶的作用下，醬醅中的酪蛋白氧化產生黑色素[29]。隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵后期保溫發(fā)酵的溫度升高，醬醅中多酚氧化酶活性降低，此時美拉德反應是黑色素的主要來源[30]，使醬的顏色逐漸變深，醬的顏色越深，則表現為醬色差異增大。發(fā)酵前期，4 種菌種發(fā)酵后醬醅醬色差異較明顯，米曲霉和黑曲霉的增長趨勢較酵母和毛霉的增長趨勢更大。這是由于發(fā)酵前期曲霉多酚氧化酶活性高于酵母和毛霉，致使曲霉產酶能力高于酵母和毛霉，因此由黑曲霉和米曲霉發(fā)酵的蠶豆醬顏色較深。米曲霉醬色差異變化趨勢與黑曲霉醬色差異趨勢基本一致。因此，選用米曲霉、黑曲霉為優(yōu)勢菌種。

2.4 蠶豆醬的品質

成品蠶豆醬的氨基酸態(tài)氮、總酸含量及感官評分如表2所示。

氨基酸態(tài)氮含量是蠶豆醬重要的質量指標之一，國家標準GB 2718—2014《食品安全國家標準釀造醬》要求釀造醬氨基酸態(tài)氮不少于0.3 g/100 g，由表2 可知，以米曲霉為優(yōu)勢菌種發(fā)酵制成的蠶豆醬氨基酸態(tài)氮含量為（1.516±0.046）g/100 g，符合國家標準，也說明米曲霉降解蛋白質的能力較強，能降解蛋白質產生氨基酸為蠶豆醬提供主要的鮮味[2]。總酸指醬醅中有機酸的含量，是反映醬制品發(fā)酵程度的重要指標之一，該蠶豆醬總酸含量為（1.811±0.098）g/100 g，符合國家標準中釀造醬總酸不超過2.0 g/100 g 的規(guī)定。

感官評價是對產品質量最直觀的反映。由表2 可知，經選評員對接種米曲霉制曲發(fā)酵30 d 的蠶豆醬進行感官評價，其色澤、氣味、口感、組織特性得分均在20 分以上，總分達到83，人們易于接受。

3 結論

本試驗以去皮蠶豆為主要原料，經蒸熟、冷卻、拌入面粉、接種、發(fā)酵等工藝，以米曲霉、黑曲霉、毛霉、酵母菌4 種單一菌種純種發(fā)酵制曲制作蠶豆醬，分別測定蠶豆醬發(fā)酵前期（1、3、5、7 d）醬醅的總酸含量、氨基酸態(tài)氮含量以及醬色差異的變化。結果表明：以米曲霉為菌種發(fā)酵制曲，發(fā)酵前期醬醅中的總酸含量最低，氨基酸態(tài)氮含量最高，醬色差異最大。因此選用米曲霉作為蠶豆醬前期發(fā)酵的優(yōu)勢菌種。通過驗證試驗發(fā)現：經由米曲霉接種制曲發(fā)酵所得的蠶豆醬，其顏色呈黃褐色，色澤鮮艷，濕潤有光澤，醬香、酯香協調，氣味輕柔，口感鮮、香、醇，醬體滋潤飽滿，無肉眼可見的雜質，感官評分為83，所測得的氨基酸態(tài)氮含量為1.516 g/100 g，總酸含量為1.811 g/100 g，所測指標均符合相應國家標準的要求。本文對豐富蠶豆醬的風味、提高蠶豆醬的質量具有積極的意義。