淡竹葉多糖的制備、熱穩定性及其抗氧化活性

邢慧珍，張玉梅，劉會平，喬賽鳳

（天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457）

多糖是指由10 個或10 個以上的單糖通過糖苷鍵連接而成的大分子物質，廣泛存在于動植物和微生物中[1]，可分為動物多糖、植物多糖或真菌多糖[2]。大量研究發現，多糖具有抗腫瘤[3]、抗氧化[4]、抗凝血[5]、調節腸道菌群等生物活性功能。不同提取方法、樣品來源均會影響多糖的生物活性和結構特征[6]。常用的多糖提取方法有水提法、酶解輔助提取法、超聲波輔助提取法、酸堿浸提法和微波輔助提取法等。

淡竹葉（Lophatherum gracileBrongn.）是多年生草本植物的莖葉，是一種藥食同源的食材，屬被子植物門、單子葉植物綱、禾本科、淡竹葉屬，通常生長在山坡下陰濕處，廣泛分布在我國長江以南地區[7]。淡竹葉別名有碎骨子、山雞米、迷身草和竹葉卷心等。對淡竹葉的記載首次出現在《滇南本草》，《本草綱目》首次記錄了淡竹葉的形態特征。淡竹葉性味甘淡，可作藥用，具有清熱止渴、利尿通淋的功效，通常應用于熱病煩渴、小便短赤澀痛、痛頭風、吐血等病癥的治療，民間大多使用淡竹葉莖葉制作涼茶來飲用。淡竹葉也可直接食用，可與粥一起煮食或者將淡竹葉煮水飲用。淡竹葉中含有大量的黃酮類、多糖類、氨基酸、葉綠素、微量元素等成分，使淡竹葉具有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤等作用[8-10]。

研究者對淡竹葉的研究大部分集中在淡竹葉的化學成分分析和營養價值方面，而對淡竹葉多糖熱穩定性和抗氧化活性的研究鮮有研究。由于水提法具有操作簡單、成本較低和不會對多糖結構造成破壞的優點，本研究選用水提法來提取淡竹葉多糖，并通過單因素試驗和響應面法對提取工藝條件進行優化，分離純化后得到一種新型的淡竹葉多糖（Lophatherum gracileBrongn.polysaccharide，LGP），分析其熱穩定性和抗氧化活性，為淡竹葉多糖的實際生產應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

淡竹葉：市售；三氯甲烷、三氟乙酸、無水乙醇、正丁醇、甲醇：江天化工技術股份有限公司；T 系列葡聚糖：北京索萊寶科技有限公司；間羥基聯苯、考馬斯亮藍-G250、牛血清蛋白：北京索萊寶科技有限公司；葡聚糖凝膠Sephadex G-200：上海源葉生物科技有限公司；單糖標品（鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖醛酸等）：美國Sigma 公司；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DZF-6020 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海博迅實業有限公司；SE-750 型高速粉碎機：浙江永康市圣象電器有限公司；TDZ5-WS 型低速離心機：長沙湘儀儀器有限公司；FD-1A-50 型冷凍干燥機：上海比朗儀器制造有限公司；RE-52A 型旋轉蒸發儀：上海亞榮生化儀器廠；1200 型高效液相色譜（high performance liquid chromatograph，HPLC）儀：安捷倫科技有限公司；UV-2550PC 型紫外可見光分光光度計、60Plus 型差示掃描量熱儀：日本島津公司；HGC-12A 型氮吹儀：天津市恒奧科技發展有限公司；ICS-5000 型離子色譜儀：戴安中國有限公司；TGA-Q500 型熱重分析儀：美國TA 公司；Synergy HTX 型多功能酶標儀：美國博騰公司。

1.3 淡竹葉多糖的提取工藝優化

1.3.1 淡竹葉的預處理

將淡竹葉放入烘箱進行干燥，粉碎成粉末狀后用80 目篩網過濾，淡竹葉粉末在索氏抽提裝置中使用石油醚進行脫脂處理，之后在60 ℃鼓風干燥箱中進行干燥，時間為72 h[11]。

1.3.2 淡竹葉粗多糖的提取工藝流程

處理后的淡竹葉脫脂粉末與蒸餾水按照一定的液料比在100 ℃條件下多次萃取，冷卻至室溫后進行離心（4 000 r/min 離心15 min）、過濾，將上清液合并，用旋轉蒸發儀將其體積濃縮至原來的1/4 后與無水乙醇按照比例進行混合，放入4 ℃冰箱過夜，第2 天對混合液進行離心處理，小心倒掉上清液，獲得的醇沉沉淀物即為淡竹葉粗多糖[12]。粗多糖得率（D，%）按照下面的公式進行計算。

式中：M1為淡竹葉粗多糖質量，g；M2為淡竹葉粉末樣品質量，g。

1.3.3 單因素試驗

提取溫度定為100 ℃，考察液料比、提取時間、提取次數和醇沉濃度4 個因素對淡竹葉粗多糖得率的影響。

1）液料比分別設定為10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1（mL/g），浸提2 h，提取次數為2，醇沉濃度為60%。

2）提取時間分別設定為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，液料比為30 ∶1（mL/g），提取次數為2，醇沉濃度為60%。

3）提取次數分別設定為1、2、3、4、5，浸提2 h，液料比為30 ∶1（mL/g），醇沉濃度為60%。

4）醇沉濃度分別設定為40%、50%、60%、70%、80%，液料比為30 ∶1（mL/g），浸提2 h，提取次數為2。

1.3.4 響應面因素水平設計

根據Box-Behnken 原理，選取液料比、提取時間和醇沉濃度為自變量，淡竹葉粗多糖得率（Y）為響應值，做三因素三水平響應面設計，優化淡竹葉粗多糖的提取工藝。響應面因素水平設計見表1。

表1 響應面因素水平設計Table 1 Factors and levels of response surface design

1.4 淡竹葉多糖的分離純化

1.4.1 淡竹葉粗多糖的分子量分布

準確稱取淡竹葉粗多糖2 mg，溶于2 mL 超純水中，使用漩渦混勻儀將粗多糖充分溶解，過0.22 μm 濾膜，使用高效液相色譜儀對淡竹葉粗多糖的分子量分布進行檢測分析。檢測條件：選用RID 檢測器，設置檢測器的溫度為35 ℃，柱溫設定為30 ℃，進樣量為20 μL（1 mg/mL），流動相使用超純水，流速設置為0.6mL/min。

1.4.2 淡竹葉多糖的純化

將淡竹葉粗多糖溶液去除酒精后，用蒸餾水復溶，通過離心（8 000 r/min，10 min）去除雜質。然后用sevag法[正丁醇∶三氯甲烷=4 ∶1（體積比）]去除粗多糖中的蛋白質[13]，除去蛋白質后使用旋轉蒸發儀去除sevag 試劑，之后用蒸餾水在4 ℃條件下透析3 d（截留相對分子量為10 000 Da）。用冷凍干燥機進行干燥收集多糖，收集后的多糖用蒸餾水配制成20 mg/mL 的多糖溶液，過膜后用Sephadex G-200 凝膠柱（1.6 cm×40 cm）進一步純化多糖，收集洗脫曲線最高峰的那一管，冷卻干燥后得到淡竹葉多糖，命名為LGP。

1.4.3 淡竹葉多糖（LGP）的純度鑒定

1.4.3.1 基本成分測定

以D-葡萄糖作為標品，采用苯酚-硫酸法測定淡竹葉粗多糖和LGP 的總糖含量[14]；還原糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸法[15]；以半乳糖醛酸為標品，多糖中糖醛酸含量的測定采用間羥基連苯法[16]；以牛血清蛋白為標品，用考馬斯亮藍法測定多糖中的蛋白質含量[17]。

1.4.3.2 LGP 的分子量測定

LGP 的相對分子量使用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）法測定。將1 mg 的淡竹葉多糖樣品溶于1 mL 的超純水中，使用漩渦混勻儀渦旋后過0.22 μm 濾膜，使用高效液相色譜儀檢測。將T 系列（T-3、T-10、T-70、T-100、T-300、T-500、T-2000）葡聚糖標準品配制成1 mg/mL的溶液，根據其分子量和保留時間繪制標準曲線，將測得的LGP 的保留時間代入標準曲線計算得到LGP的相對分子量[18]。

1.4.3.3 LGP 的紫外全波段掃描

準確稱取1 mg 的LGP，溶于10 mL 蒸餾水中，配制成濃度為0.1 mg/mL 的淡竹葉多糖溶液，空白對照組選用蒸餾水，使用紫外分光光度計進行檢測，選取的波長范圍為200～400 nm。

1.5 淡竹葉多糖的單糖組成測定

1.5.1 多糖降解

稱取5 mg 的LGP，將其溶于1 mL 的三氟乙酸（2 mol/L）中，混勻后在油浴鍋（110 ℃）中油浴3 h，反應結束后在室溫條件下自然冷卻，使用氮氣將溶液吹干。為了除去多糖溶液中殘留的三氟乙酸，需要加入0.5 mL 甲醇后再使用氮吹儀吹干，反復3 次直至完全除凈。

1.5.2 檢測單糖組成

單糖組成通過離子色譜法（ion chromatography，IC）來測定，參考文獻[19]的方法對檢測結果進行分析。使用超純水將完全溶解后的多糖溶液稀釋成濃度為0.1 mg/mL 的溶液。準確稱取巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、核糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸10 種單糖標品各1 mg，使用超純水將其配制成濃度為0.05 mg/mL 的單糖標品混合溶液。制備得到的多糖溶液與單糖標品分別使用0.22 μm 濾膜和RP-10 柱處理后，采用離子色譜儀檢測。

1.6 淡竹葉多糖熱穩定性的測定

1.6.1 LGP 的差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）測定

精準稱取4 mg 的LGP 樣品，用壓片機處理后放入樣品池中，使用差示掃描量熱分析儀在25～200 ℃范圍進行檢測，升溫速率為10 ℃/min。

1.6.2 LGP 的熱重（thermogravimetric analyzer，TGA）測定

稱取LGP 樣品5 mg，將其放入托盤中，托盤邊緣不能有余留，使用熱重分析儀測定LGP 的熱穩定性。測定條件如下：通入的氣體為氮氣，設置儀器溫度范圍為25～600 ℃，升溫速率為20 ℃/min。

1.7 淡竹葉多糖的抗氧化活性測定

準確稱取淡竹葉純多糖100 mg，使用10 mL 蒸餾水將其溶解，得到10 mg/mL 的淡竹葉多糖溶液，之后分別稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.6、3.2、6.4、8.0 mg/mL的淡竹葉多糖溶液。選用VC作為陽性對照。

1.7.1 LGP 對DPPH·的清除能力

參考文獻[20]的方法，向試管中分別加入1 mL 不同濃度的淡竹葉多糖溶液，再加入5 mL DPPH 溶液（0.2 mmol/L），充分混合后在避光條件下反應30 min，設置酶標儀參數，檢測其在517 nm 處的吸光度。按照式（2）計算DPPH 自由基的清除率（RDPPH，%）。

式中：Ai為樣品+DPPH 溶液的吸光度；Aj為樣品+蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水+DPPH 的吸光度。

1.7.2 LGP 對·OH 的清除能力

取8 支干凈的10 mL 試管，向其中添加不同濃度的LGP 溶液（1 mL），再依次加入等體積的FeSO4（6 mmol/L）、水楊酸-乙醇溶液（6 mmol/L）和H2O2溶液（6 mmol/L），混合均勻后在37 ℃恒溫水浴中反應30 min，使用酶標儀檢測其在510 nm 處的吸光度[21]。按照式（3）計算·OH 的清除率（ROH，%）。

式中：Ai為加入樣品溶液的吸光度；Aj為將H2O2替換成去離子水的吸光度；A0為將樣品替換成去離子水的吸光度。

1.7.3 LGP 的ABTS+自由基的清除能力

將7 mmol/L 的ABTS 溶液與2.45 mmol/L 過硫酸鉀溶液等體積混合，避光反應24 h，向混合液中加入無水乙醇，將其吸光度調節至0.70±0.02，得到ABTS 工作液。分別加入不同濃度的LGP 溶液（0.4 mL），然后加入4 mL 的ABTS 工作液，反應5 min，測量其在734 nm處的吸光度[22]。按照式（4）計算ABTS＋自由基清除率（RABTS+，%）。

式中：Ai為樣品+ABTS 工作液的吸光度；Aj為樣品+蒸餾水的吸光度；A0為蒸餾水+ABTS 工作液的吸光度。

1.7.4 LGP 的還原力測定

向試管中加入不同濃度的LGP 溶液（0.5 mL）和2.5 mL 的磷酸沖液緩（0.2 mol/L，pH6.6），最后加入2.5 mL 的鐵氰化鉀溶液（1%），50 ℃恒溫水浴20 min，室溫靜置反應10 min，再加入三氯乙酸（2.5 mL，10%），將混合物離心（3 000 r/min，10 min）以獲得上層。取2.5 mL 的上層溶液，向其中加入蒸餾水（2.5 mL）和0.1%氯化鐵（0.5 mL），反應10 min，選擇酶標儀測定其在700 nm 處的吸光度[23]。按照式（5）計算LGP 的還原能力（ΔA）。

式中：A為樣品組的吸光度；A0為VC組的吸光度。

1.8 數據分析

試驗重復3 次以上，數據用平均值±標準差表示。使用SPSS 26.0 軟件對數據進行分析；統計學顯著性選擇單因素方差分析（ANOVA）說明；使用Origin 2018 軟件處理圖表。P<0.05 表明具有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 不同液料比對淡竹葉粗多糖得率的影響

在多糖提取過程中，如果提取液所占比例太小可能會造成多糖不能被完全提取，而且對原料中的活性成分也會造成一定的損失；但若提取液所占比例過多，又會造成不必要的浪費，增加生產成本。液料比對粗多糖得率的影響見圖1。

圖1 液料比對粗多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of crude polysaccharide

由圖1 可知，本研究選取的液料比范圍為10 ∶1～50 ∶1（mL/g）。當液料比在10 ∶1～30 ∶1（mL/g）內時，淡竹葉粗多糖的得率增加效果明顯，這可能是因為液料比數值小于30 ∶1（mL/g）時，淡竹葉內外滲透壓隨液料比的增加而增加，使多糖向提取液的方向釋放[24]。而當液料比大于30 ∶1（mL/g）時，淡竹葉粗多糖的得率增長緩慢，但是一直處于增長狀態，這可能是因為不斷增加溶劑體積，會使淡竹葉中的多糖不斷溶出，直至趨于平衡[25]。因此，出于節約能源和成本的考慮，選擇液料比為10 ∶1、30 ∶1、50 ∶1（mL/g）進行響應面分析。

2.1.2 不同提取時間對淡竹葉粗多糖得率的影響

提取時間對粗多糖得率的影響見圖2。

圖2 提取時間對粗多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of crude polysaccharide

如圖2所示，隨著提取時間從0.5 h 延長到2.0 h，淡竹葉多糖的得率從（2.52±0.09）%增加至（4.72±0.14）%，繼續延長提取時間，多糖得率有所降低。這可能是因為絕大部分多糖在2.0 h 內被提取出來，而2.0 h后粗多糖的得率降低，原因可能是由于多糖的結構在持續的高溫作用下遭到破壞導致的[26]。因此，選擇提取時間1.0、2.0 h 和3.0 h 進行后續的響應面分析。

2.1.3 不同提取次數對淡竹葉粗多糖得率的影響

提取次數對粗多糖得率的影響見圖3。

圖3 提取次數對粗多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction times on the yield of crude polysaccharide

由圖3 可知，在選定的范圍內（1～5 次）淡竹葉粗多糖的得率隨著提取次數的增加而顯著增加，而當提取次數為3 時，淡竹葉粗多糖的得率為（4.73±0.11）%，繼續增加提取次數，多糖得率變化不明顯，趨于平緩。這可能是由于淡竹葉中的多糖已大部分溶解，再增加提取次數不僅對多糖的得率無明顯影響[27]，還可能會使多糖的結構發生改變，同時也會使其它雜質溶出[28]。因此，從節約能源的角度來看，確定提取3 次為最佳提取次數。

2.1.4 不同醇沉濃度對淡竹葉粗多糖得率的影響

醇沉濃度對粗多糖得率的影響見圖4。

圖4 醇沉濃度對粗多糖得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration for precipitation on the yield of crude polysaccharide

由圖4 可知，當醇沉濃度小于60%時，淡竹葉粗多糖的得率隨醇沉濃度的增加而顯著增加。當醇沉濃度為60%時，淡竹葉粗多糖的得率為（4.53±0.10）%，繼續增大醇沉濃度，多糖得率增長較少。因此，從考慮成本和節約能源來看，選擇醇沉濃度為50%、60%和70%進行后續響應面優化試驗。

2.2 響應面試驗

利用Design Expert 10.0.7 軟件，參照Box-Behnken Design 原理，選擇液料比（A）、提取時間（B）、醇沉濃度（C）為自變量，響應面試驗設計與結果見表2。方差分析結果見表3。

表2 響應面試驗設計與結果Table 2 Design and results of response surface experiments

結果表明，各自變量之間存在的二次多項式關系為Y=4.626+0.375A+0.266B+0.259C-0.26AB-0.365AC+0.368BC-1.067A2-0.599B2-1.044C2。

如表3所示，失擬項的F值和P值分別為1.42 和0.360 4，這表明該模型擬合不顯著。模型的R2Adj為0.932，說明該模型可以解釋大部分（93.2%）的變化，表明所建立的多項式模型方程具有普遍有效性和準確性。方差分析的結果表明，淡竹葉粗多糖得率的二次多項式模型是極顯著的，除液料比和提取時間的交互作用對淡竹葉多糖得率的影響不顯著外，其余各因素對粗多糖得率影響均顯著。通過F值的大小可知，液料比對淡竹葉粗多糖得率的影響最顯著，其次是提取時間，最后是醇沉濃度。

各因素相互作用及對粗多糖得率響應面3D 圖和等高線圖見圖5。

圖5 液料比、提取時間、醇沉濃度相互作用及對淡竹葉粗多糖得率的響應面3D 圖和等高線圖Fig.5 Three-dimensional response surface plots and contour plots of interactions between liquid-to-solid ratio，extraction time，and ethanol concentration for precipitation on the yield of crude polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖5 可知，液料比和提取時間的3D 圖坡度最平緩，說明液料比和提取時間的交互作用對淡竹葉粗多糖得率的影響較弱，這一結果與表3 的結果相一致。淡竹葉多糖的最優提取工藝條件為液料比32.44 ∶1（mL/g），提取時間2.24 h，醇沉濃度為61.44%，預測淡竹葉粗多糖的得率為4.67%。充分考慮到實際工業生產的需要，將得到的最優條件進行修改，最終選取液料比30 ∶1（mL/g），提取時間2 h，醇沉濃度60%，在此條件下進行重復3 次，淡竹葉粗多糖得率為（4.54±0.26）%，其與預測值之間的相對誤差為0.13%<5%，說明模型建立成功且修正后的提取條件具備較高的可行性。

2.3 淡竹葉粗多糖的分子量分布

淡竹葉粗多糖的高效液相色譜圖和洗脫曲線見圖6。

圖6 淡竹葉粗多糖的高效液相色譜圖和洗脫曲線Fig.6 High performance liquid chromatogram and elution curve of the crude polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖6 可知，淡竹葉粗多糖有一個明顯的峰，出峰時間為9.210 min，其它兩個峰較小，出峰時間分別為11.348 min 和13.422 min。由于第一個組分組分占比較大，因此選擇分離第一個組分。從圖中可見，有2 個明顯的獨立洗脫峰，還有一個洗脫峰不是很明顯，分析比較通過高效液相色譜儀得到的分子量大小，可以確認第一個洗脫峰應該就是需要分離的組分，收集該組分，通過真空冷凍干燥機凍干得到淡竹葉純多糖，命名為LGP。

2.4 LGP 的純度鑒定

2.4.1 淡竹葉多糖的成分及含量分析

LGP 基本化學成分見表4。

表4 LGP 基本化學成分Table 4 Basic chemical components of LGP %

由表4 可得，經過分離純化后LGP 的總糖含量為（93.40±0.96）%，蛋白質含量為（1.71±0.64）%，糖醛酸含量為（5.50±0.78）%，且不含有還原糖。綜上所述，LGP是一種純度較高，蛋白質含量較少的中性多糖。

2.4.2 淡竹葉多糖的相對分子量分析

淡竹葉葉純化多糖的高效液相色譜圖見圖7。

圖7 淡竹葉葉純化多糖的高效液相色譜圖Fig.7 High performance liquid chromatogram of the purified polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

如圖7所示，色譜圖中出現了一個狹窄的對稱峰，這表明LGP 的相對分子量分布均勻。根據保留時間（7.562 min）計算得LGP 的相對分子量為2.32×106Da。

2.4.3 淡竹葉多糖的紫外全波長掃描結果分析

淡竹葉多糖的紫外可見光掃描譜圖見圖8。

圖8 淡竹葉多糖的紫外可見光掃描譜圖Fig.8 UV-Vis scanning spectrum of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

如圖8所示，淡竹葉多糖在260 nm 和280 nm 處有較弱的紫外可見吸收峰，這意味著淡竹葉多糖可能含有少量核酸和蛋白質，這與2.4.1 的化學分析結果一致。

2.5 LGP 的單糖組成分析

使用離子色譜儀對LGP 的單糖組成進行檢測，與標品對照分析。標準品和LGP 的完全水解產物的保留時間如圖9所示。

圖9 離子色譜圖Fig.9 Ion chromatograms

圖9 表明，淡竹葉多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸組成，其中阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖含量相對較高，其余的單糖和糖醛酸含量較少。計算得出LGP 中鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸的摩爾比為0.115 ∶2.453 ∶3.176 ∶0.780 ∶1.000 ∶0.430 ∶0.239 ∶0.018。根據LGP 的離子色譜圖可知LGP 含有少量糖醛酸，這與間羥基聯苯法的結論一致。

2.6 淡竹葉多糖熱穩定性分析

2.6.1 LGP 的差示掃描量熱（DSC）分析

LGP 的DSC 分析見圖10。

圖10 LGP 的DSC 分析Fig.10 Differential scanning calorimetry of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖10 可知，LGP 在76.4 ℃出現一個吸熱峰，這個過程主要是由于固態構型的崩解與突變造成的。在之后的升溫過程中多糖沒有出現放熱峰，這表明淡竹葉多糖有較好的熱穩定性[29]。

2.6.2 LGP 的熱重（TGA）測定

LGP 的TGA 分析見圖11。

圖11 LGP 的TGA 分析Fig.11 Thermogravimetry analysis of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖11 可得，LGP 的TGA 分解過程大致可分為3 個階段。第一階段在50 ℃左右，失重率為13.66%，這一階段是淡竹葉多糖樣品失去由于物理作用吸附在多糖上的水分，這表明LGP 上會吸附著少量水分。第二階段，溫度變化范圍為200～400 ℃，此階段失重最為明顯，失重率達到了65.02%，淡竹葉多糖在該溫度范圍內發生了劇烈的分解，從而使淡竹葉多糖樣品重量顯著降低。第三階段，溫度變化范圍是450～600 ℃，此階段樣品的重量變化趨于平緩，為緩慢碳化階段，大部分樣品在此階段內分解為灰分和無機成分。綜上所述，LGP 在200 ℃內具有良好的熱穩定性，這與DSC結果相一致。

2.7 淡竹葉多糖的抗氧化活性測定

2.7.1 LGP 對DPPH·的清除能力

淡竹葉多糖對DPPH 自由基清除能力試驗結果見圖12。

圖12 淡竹葉多糖對DPPH 自由基清除能力Fig.12 DPPH radical scavenging ability of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖12 可知，淡竹葉多糖在0～8 mg/mL 濃度范圍內具有一定的DPPH·的清除能力[30]。VC和淡竹葉多糖濃度為8 mg/mL 時清除作用最強，清除率分別為96.5%、50.0%。經計算，LGP 和VC的IC50值分別為8.710 mg/mL和1.148 mg/mL，這說明LGP 具有一定的DPPH·清除能力，但效果遠弱于VC。LGP 的DPPH·清除能力與其分子量和單糖組成有關[31-32]。Lo 等[33]發現，阿拉伯糖與葡萄糖的比例越高，香菇多糖的抗氧化能力越低。因此，半乳糖和阿拉伯糖是影響LGP 清除DPPH 自由基的關鍵因素。由于LGP 是一種大分子多糖，而且LGP的半乳糖含量與阿拉伯糖和葡萄糖的比例較高，所以其DPPH·清除能力較弱。

2.7.2 LGP 對·OH 的清除能力

生命體中最具氧化性能的自由基為·OH，若不快速及時清除，會破壞機體的腑臟器官[34]。淡竹葉多糖對·OH 的清除能力見圖13。

圖13 淡竹葉多糖對·OH 的清除能力Fig.13 OH radical scavenging ability of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖13 可知，淡竹葉多糖的羥基自由基清除能力與濃度呈正相關。VC和淡竹葉多糖濃度為8 mg/mL時清除作用最強，清除率分別為99.6%、64.4%，計算得到LGP 和VC的IC50值分別為3.947 mg/mL 和0.305 mg/mL，這說明LGP 具有較好的·OH 的清除能力。LGP 對·OH 的清除能力較強與其單糖組成中木糖的含量較高有關[35]。

2.7.3 LGP 的ABTS＋自由基的清除能力

淡竹葉多糖對ABTS＋自由基清除能力見圖14。

圖14 淡竹葉多糖對ABTS＋自由基清除能力Fig.14 ABTS＋radical scavenging ability of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖14 可知，淡竹葉多糖具有良好的ABTS＋自由基清除能力。當濃度增加到8.0 mg/mL 時，清除率達到74.8%，接近于VC。經計算，LGP 和VC的IC50值分別為1.134 mg/mL 和0.068 mg/mL，由此可見，淡竹葉多糖對ABTS＋由由基具有較強的清除作用，這一般與LGP 中的半乳糖含量較高有關[36]。Sharma 等[37]將部分純化后的辣木葉多糖與其粗提取物進行了比較，結果表明由于純化后的辣木多糖具有較高的半乳糖含量（38.08%），所以純化后的辣木多糖具有較好的ABTS+·清除能力。

2.7.4 LGP 的還原力測定

多糖分子中存在的苷羥基可在一定條件下可以異變為羰基結構，因而具有還原性。吸光度反映物質的還原能力，吸光度越大，待測物質的還原能力越強[38]。淡竹葉多糖的還原能力見圖15。

圖15 淡竹葉多糖的還原能力Fig.15 Reducing ability of the polysaccharide from Lophatherum gracile Brongn.

由圖15 可知，在選定的濃度范圍內淡竹葉多糖具有一定的還原能力，但始終弱于同等質量濃度下VC的還原能力。淡竹葉多糖的還原能力隨多糖濃度的增加而增強，當濃度增加到8.0 mg/mL 時，還原力達到0.574。Wang 等[39]發現糖醛酸中的COOH 和Fe2+之間形成的跨橋是多糖具有Fe2+螯合能力的原因。Zhang 等[40]發現糖醛酸含量與還原能力呈正相關。由于LGP 的糖醛酸含量較低，所以其還原能力也較弱。

3 結論

本研究通過單因素試驗和響應面相結合的方法得到了淡竹葉多糖的最優提取工藝條件為液料比30 ∶1（mL/g），提取時間2 h，醇沉濃度60%，在上述提取工藝條件下，淡竹葉粗多糖的得率（4.54±0.26）%。分離純化后的淡竹葉多糖LGP 經測定可得其總糖、蛋白質和糖醛酸含量分別為（93.40±0.96）%、（1.71±0.64）%、（5.50±0.78）%，平均相對分子量為2.32×106Da。LGP 主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸組成，其摩爾比為0.115 ∶2.453 ∶3.176 ∶0.780 ∶1.000 ∶0.430 ∶0.239 ∶0.018。利用DSC 和TGA 對淡竹葉多糖的熱穩定性進行探究，結果證實LGP 在200 ℃以內具有良好的熱穩定性。

對淡竹葉多糖LGP 進行了抗氧化活性試驗，結果表明淡竹葉多糖對DPPH 自由基、羥基自由基、ABTS+自由基均具有一定的清除能力，且清除能力大小順序為ABTS+自由基>羥基自由基>DPPH 自由基，由此可得淡竹葉多糖是一種潛在的天然抗氧化劑，可應用于食品、藥品等領域。通過總還原力測定結果可得其還具有一定的還原能力。本研究所得的淡竹葉多糖是一種得率較高、相對分子量較大且具有良好熱穩定性的多糖，可作為一種新型的天然抗氧化劑，本研究也為淡竹葉多糖的生產應用提供了理論支持。