肽鋅絡合物促鋅吸收機制研究進展

王思怡，楊晰茗，王震宇，杜明，程述震

（大連工業大學食品學院國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧大連 116034）

鋅（Zn）是人體的必需營養物質之一，對人類的生命活動有不可替代的作用，被稱為“生命元素”，其在體內位居過渡金屬含量排名第二，僅次于鐵[1]。作為人體中300 多種金屬酶的輔因子[2]，鋅可以通過調節不同酶的活性，控制細胞的信號傳導途徑。味覺下降食欲減退[3]、生長發育遲緩和免疫功能受損等[4]許多不良健康狀況均與鋅缺乏有關。盡管鋅元素的作用越來越被認知和重視，全世界依然約有三分之一人口患有不同程度的缺鋅癥，特別是發展中國家[5]。人體缺鋅主要有兩個原因，一是日常飲食中鋅攝入量很難達到鋅的推薦膳食供給量（recommended dietary allowance，RDA），而機體又無法合成鋅；二是攝入食物或胃腸道中含有高水平的抗營養素，如植酸、草酸等，會與鋅形成不溶性絡合物，導致鋅的吸收利用率低下。特別是處于生理活動相對活躍時期的母嬰、兒童及青少年，對于鋅的需求量高，更加容易發生缺鋅狀況[6]。目前應對鋅缺乏的主要策略：調整膳食結構，增加飲食多樣性，增加動物內臟、堅果等富含鋅的食物的攝入；攝入鋅補充劑，如無機鋅（硫酸鋅）、有機鋅（葡萄糖酸鋅、檸檬酸鋅和氨基酸螯合鋅）、生物鋅（酵母鋅）等；通過在生產中增加食用農作物礦物鋅的濃度或生物利用性進行生物強化[7]。

近年來，各種補鋅制劑相繼出現。一代氧化鋅、氯化鋅、硫酸鋅等無機鋅源補充劑，雖然可以達到補鋅的效果，但由于其對胃腸道的刺激性和毒性等原因，已經鮮少作為人體的補鋅劑。第二代補鋅制劑是簡單的有機酸鋅，包括葡萄糖酸鋅、檸檬酸鋅、甘草酸鋅和乳酸鋅等，第二代補鋅制劑同第一代相比，對胃腸道的刺激和副作用明顯減少，口服利用率高，但由于有機酸鋅屬于弱酸弱堿鹽，易與體內胃酸發生反應生成一定的有毒物質（氯化鋅），因而不宜長期食用。第三代補鋅制劑被稱為蛋白鋅，是以氨基酸和多肽為配體，以鋅離子為中心原子，經配位鍵連接制備的，與無機鋅和有機酸鋅相比，蛋白鋅的穩定性和生物利用度更高[8]，應用潛力巨大。多肽鋅絡合物的吸收形式和機制的不明晰，限制了高效鋅補充劑的開發。本文通過對肽鋅絡合物的特性、多肽與鋅結合能力的影響因素及肽鋅絡合物的吸收機制等方面的綜述介紹該物質的研究進展，為肽鋅絡合物深度開發利用提供參考。

1 肽鋅絡合物性質決定其促鋅吸收能力

1.1 胃腸穩定性

在結構上，無機鹽僅由陰陽離子間的離子鍵構成，而鋅元素與多肽絡合形成的特殊結構具有良好的穩定性。鋅離子與給電子體的氨基酸形成配位鍵，同時與其羧基構成離子鍵進而形成獨特的結構，分子內電荷趨于中性，較難解離[9]。

在生理pH 值下，鋅離子易沉淀，這是導致其生物利用率較低的主要原因。而肽鋅絡合物具有較好的pH值穩定性，不易與其他物質結合形成不溶性化合物，其結構可以保護微量元素鋅免受其他物質和胃腸道中干擾成分的干擾，保護自身理化性質，使鋅順利到達吸收部位[10]。同時絡合物形式可以提高溶解度，為鋅離子在小腸中的吸收創造有利的條件[11]。Tian 等[12]采用響應面優化制備梅花鹿血多肽與鋅絡合物，通過體外模擬消化試驗發現，與無機鋅鹽相比，梅花鹿血肽鋅絡合物在胃腸道環境中有更好的鋅滲透性，同時與多肽絡合后可提高肽鋅絡合物的溶解度，進而提高鋅離子利用率。

1.2 減少其他干擾物質的拮抗作用

消化道中影響鋅離子穩定存在的因素有磷酸鹽、氫氧化物、植酸鹽等，這些物質可以與鋅形成穩定的絡合物阻礙鋅的吸收。肽鋅絡合物以多肽為載體構建了鋅吸收的新形式，提高鋅的生物利用率。

此外Zn2+與Fe2+、Ca2+等二價金屬離子之間可能存在拮抗作用，影響鋅離子的吸收。Jayalakshmi 等[13]研究發現，鐵和鈣分別對鋅的吸收有抑制作用，在缺鋅大鼠補鋅期間進行鐵鈣干預，發現同時補充鐵鈣時，對鋅的抑制作用更加顯著。而肽鋅絡合物的生化穩定性對鋅離子起保護效果，有效抑制了礦物質元素的相互作用，從而減少了營養物質的損失，增強了其吸收利用度。

1.3 肽鋅絡合物存在潛在吸收位點

研究表明，經胃消化的膳食中游離型鋅離子進入小腸環境后以陽離子形態存在，但其必須與內（外）源性有機體結合，形成具有脂溶性表面的絡合物后，才能通過黏膜細胞的類脂質屏障，進而被小腸細胞吸收轉運[14]。在體外，以多肽為載體構建鋅吸收的原始形式（脂溶性有機體），具有通過細胞膜上多肽通道吸收的潛質，避免了鋅離子游離形態與其他二價金屬離子競爭金屬轉運蛋白，提高鋅的生物效價。

2 影響肽鋅絡合物穩定性的因素

多肽具有較好的鋅結合能力，它們與鋅形成配位絡合物后，以穩定的形式確保鋅的運輸和吸收。面對復雜的胃腸道環境，了解物質結合機制并強化其結構才能保障肽鋅絡合物發揮功效。研究發現，氨基酸組成、分子量、電荷等因素與肽鋅絡合物的穩定性息息相關，這些因素直接影響了多肽的結構性質及其鋅結合能力。

2.1 氨基酸組成和序列

肽的氨基酸組成和排列順序一般是影響肽活性最重要的方面[15]，同時不同氨基酸組成的多肽會有不同的鋅離子結合能力。表1 總結了經鑒定具有礦物鋅結合能力的一些食物蛋白衍生肽序列。

表1 鋅絡合肽的結構特性Table 1 Structural properties of peptides binding to zinc

由組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、絲氨酸等氨基酸殘基組成的多肽，其側鏈可作為結合過渡金屬的配體，目前已經證實半胱氨酸和組氨酸殘基是鋅離子的結合配體[21]。如表1所示，有些多肽的鋅離子結合能力具有明顯優勢，其原因是具有較多的鋅離子結合位點和較高的結合強度。例如，芝麻蛋白肽Asn-Cys-Ser 鋅離子結合能力（73.7%）優于Ser-Met（56.1%）和Leu-Ala-Asn（49.0%），可能是由于其自身含有的能夠與鋅離子結合的氨基酸殘基更豐富，半胱氨酸和絲氨酸比亮氨酸和丙氨酸能更好地與金屬離子結合。Asn-Ser-Met 與Ser-Met 有類似的組成，卻表現出不同的鋅離子集合能力，推測是Asn 提供了額外的結合位點，引起更多鋅離子配位。

除此之外，某些氨基酸殘基位于-N 端或-C 端的位置，也會影響多肽的金屬結合活性[22]。芝麻蛋白肽的研究顯示Asn-Cys-Ser 表現出明顯高于Leu-Ala-Asn的鋅結合能力[18]，這說明-N 端的氨基酸殘基可能比-C端的氨基酸殘基更影響其自身金屬絡合，這一結果或許也解釋了小麥胚芽肽HNAPNPGLPYAA 比NAPLPPPLKH 鋅結合能力強的原因。

2.2 分子量

不同分子量的水解物組分具有不同的理化性質和功能性質[23]，但研究表明，不論低分子量還是高分子量的肽，均表現出金屬結合能力[24]，分子量過大或過小都在鋅結合能力方面沒有明顯優勢。如表1所示，多肽的鋅結合能力并不會因為分子量的降低而升高，反之亦是如此。從油菜籽肽中，我們可以發現最低分子量的肽Ala-Arg（245.3 Da）和最高分子量的肽Glu-Pro-Ser-His（468.5 Da）均沒有表現出最高的鋅離子結合能力（分別為34.7%、56.1%），而是Asn-Ser-Met（350.4 Da）的鋅離子結合能力（82.1%）最好。而小麥胚芽肽中較高分子量的多肽His-Asn-Ala-Pro-Asn-Pro-Gly-Leu-Pro-Tyr-Ala-Ala（1 221.3 Da）表現出異常好的鋅離子結合能力（91.7%），這表明分子量并不是影響鋅離子結合能力的主要因素。

2.3 電荷

由于鋅離子帶有正電荷，肽的結構性質尤其是電荷性質，對其結合鋅離子的能力及絡合物在胃腸道中的穩定性影響較大。王波等[25]以酪蛋白為原料制備多肽，研究電荷性質對肽鋅絡合物的影響，研究表明酪蛋白肽表面靜電荷越多，對鋅離子結合能力越強。如表1所示菜籽油多肽中的NSM 片段呈電負性（-1.0）并且具有較好的鋅結合能力（82.1%），可能是由于負電荷為鋅離子提供了更多的結合位點。Sun 等[26]在將南極磷蝦肽與鋅絡合之后發現Zeta 電位從（-29.20±0.66）mV 增加到（-10.20±0.27）mV，鋅離子中和多肽的負電荷，形態更加穩固。但更多的負電荷并不意味著更高的鋅結合能力，例如NSM 比HNAPNPGLPYAA（電荷0.1，分子量1 221.3 Da）有更低的表面負電荷和更低的分子量，但鋅結合能力卻比HNAPNPGLPYAA 低了9.6%。此外，一些肽具有相同的凈電荷，但鋅結合能力不同。例如，WLTPTYPE 和NSM 的凈電荷均為-1.0，但它們的鋅結合能力明顯不同，分別為56.9%和82.1%；類似的，GKR 和AR 的凈電荷為1.0，但它們的鋅結合能力分別為54.5%和34.7%，這表明鋅結合能力并不完全取決于凈表面電荷，也許氨基酸組成或分子量大小等因素起著更強的作用。

綜上所述，肽的鋅結合能力受氨基酸組成、肽序列、分子量、電荷等多種因素共同影響，無法由一種性質確定。為了獲得具有高鋅離子結合能力的肽，后續研究可以集中于獲取具有特定性質的多肽，并將其進行優化重組。

3 肽鋅絡合物吸收的研究模型

3.1 體外模型

主要有外翻腸囊、小腸刷狀緣膜微粒和細胞培養等。體外試驗的優點是可以控制試驗條件，干擾因素少，試驗周期短且成本低，但是因為沒有在自然狀態下動物的血液循環和腸道環境的復雜條件，因此研究中可以通過體內體外法相結合的形式進行機理研究。

3.1.1 外翻腸囊法

從活體取出小腸后，將其分割成不同的片段，將各片段外翻做成囊狀物，向其中注入不含待測物質的培養液，放入含有待測物質的培養液中培養一段時間，觀察腸道黏膜、漿膜及腸囊中被測物的變化進而評定物質的吸收情況[27]。Sun 等[28]利用外翻大鼠腸囊模型研究了扇貝內收肌水解物-鋅絡合物對Zn 的轉運/吸收，通過測定腸囊的漿膜側鋅含量和多肽組成驗證絡合物的吸收并鑒定出3 種具有代表性的腸運輸肽約為600Da，證實多肽具有較高的鋅螯合能力。

3.1.2 小腸刷狀緣膜微粒

將目標腸段取出，輕輕刮下黏膜后經離心處理獲取刷狀緣膜微粒，所得刷狀緣經培養液培養過濾，通過測定濾紙上的放射性，計量刷狀緣對元素攝入情況的影響。Tacnet 等[29]利用該方法研究鋅的吸收機制，證明鋅絡合物可以通過刷狀緣膜上鋅的特異性途徑（飽和載體、中性交換機制）或現有載體（如肽、氨基酸）轉運體介導進入刷狀邊界膜被再吸收。

3.1.3 細胞培養

細胞培養技術是將動物體內細胞取出，模擬體內生理環境，在無菌實驗室中進行培養，使細胞生存生長并維持其結構和功能的方法。在細胞培養模型研究微量元素吸收時Caco-2 細胞使用的較多。但Caco-2細胞是人的結腸癌細胞，只能代表結腸特征，同時模型中缺少黏液層和高表達載體。Sauer 等[30]利用Caco-2細胞單層模型探究氨基酸鋅絡合物的攝取機制，以及拮抗劑存在對吸收的影響。Ke 等[31]構建Caco-2 細胞單層膜模型，驗證羅非魚膠原蛋白中水解、分離和純化后的多肽與鋅離子絡合物通過緊密連接的細胞旁路轉運。

3.2 體內模型

體內法主要有原位結扎灌注腸段法、平衡實驗法、自然飼喂法和同位素示蹤技術。其優點是在保持動物正常生理狀態和腸上皮細胞的代謝活動及功能的情況下，研究營養物質的吸收變化，但是體內動物實驗個體條件控制一致相對困難，個體差異大。

3.2.1 原位結扎灌注腸段法

該方法是研究元素吸收的半體外半體內方法，麻醉動物后，取出應用腸段，結扎腸段，注入含待測元素灌注液，在腹腔中培養后測定灌注液中元素的消失率和血液及組織器官中元素的出現率估算其吸收利用和轉運情況。該方法保證了腸血管與淋巴系統的完整性，但是解剖環境與正常生理狀態下體內環境仍存在一定差異，實驗的準確性也會受充血的影響[32]。Li 等[33]采用此方法研究鐵源對肉仔雞不同腸段鐵吸收的影響及鐵的吸收動力學機制。Yu 等[34]利用原位結扎環技術評估鋅源和植酸鹽對不同腸段鋅吸收的影響，實驗證明回腸是肉仔雞腸道吸收的主要部位，且鋅的吸收受到配體和礦物質絡合程度的影響。

3.2.2 平衡實驗

平衡實驗是通過測定元素的食入量和排出量，得出動物吸收或利用的量的方法，其測定元素吸收的原理簡單，但以測定日糧中元素的食入量和排出量代表吸收和存儲來計算可能存在誤差。Seal 等[35]采用此方法研究化學因素對鋅在體內外腸道吸收的影響。

3.2.3 自然飼喂法

為研究動物腸道組織對營養元素的攝入規律，研究者開始采用自然思維的方法，該方法能體現動物完全處于自然條件下的生理狀態，所得實驗結果更接近真實情況，但是該結果受諸多因素影響，只有嚴格控制實驗條件，結果才具說服力。王再揚等[36]以缺鋅型SD 大鼠為試驗模型，通過灌胃不同形式鋅源研究牡蠣源肽（EVPPEEH）與鋅的絡合物在體內補鋅效果和吸收途徑。

3.2.4 同位素示蹤技術

同位素示蹤又稱示蹤技術，是利用放射性或穩定性示蹤劑標記原子或化合物研究被追蹤物質運動和轉化規律的方法[37]。在實際應用中研究人員常使用該技術與其他方法聯合使用以便更準確地進行元素吸收利用的研究。孫圣偉[38]應用大鼠模型結合穩定核素方法探究動物鈣代謝吸收規律。Sauer 等[30]使用了一種鋅熒光團Zinpyr1，該物質能與絡合物中的鋅結合，結合Caco-2 細胞模型研究體外氨基酸鋅中鋅的攝取，并表征其攝取途徑。

綜上所述，研究鋅吸收代謝的方法有很多，所需的實驗條件也各不相同，每種方法都有其優點和局限性，對比結果見表2。

表2 肽鋅絡合物吸收的研究方法及其優缺點比較Table 2 Advantages and disadvantages of the methods for studying the absorption of peptide-zinc complexes

只有根據自身的研究目的和現有的試驗條件選擇合適的試驗方法，才能得出對鋅的真實吸收特點和機理較為正確的認識。

4 肽鋅絡合物的吸收轉運機制

肽鋅絡合物的吸收轉運機制示意圖如圖1所示。

圖1 肽鋅絡合物的吸收轉運機制示意圖Fig.1 Absorption mechanism of peptide-zinc complex

4.1 完整吸收假說

該假說認為金屬離子與氨基酸以離子鍵和共價鍵配位結合后被保護在絡合物中，這個金屬絡合物以完整形式通過氨基酸或小肽途徑穿過黏膜細胞和細胞基底進入血液。而腸道內多肽的吸收途徑可分為4種，1）PepT1 介導轉運途徑：PepT1 為跨膜蛋白，是一種氫離子濃度梯度依賴的肽轉運載體，它結合的底物包括絕大部分的二肽，少部分的三肽以及肽類似物，但不能轉運氨基酸和四肽[39]；2）胞吞作用：胞吞是一種能量依賴的跨膜轉運途徑，物質直接結合于細胞膜上的接收器后，以囊泡形式內化于細胞，一般來說，細胞胞吞吸收的多是分子量較大的肽段；3）細胞旁路途徑：肽的細胞旁路途徑是指一些親水性小分子肽通過緊密連接處的空隙，穿透小腸上皮細胞層被機體吸收。有實驗研究表明，通過干預緊密連接蛋白的表達可以實現對細胞旁路滲透的調控[40]。4）細胞穿透途徑：細胞穿越肽具有跨細胞膜轉移能力，可將多肽從細胞外穿過細胞膜轉運至細胞內，可轉運的分子包括肽、核苷酸、寡核苷酸和蛋白質[41]。

Ashmead 等[42]通過灌注實驗結合體內同位素研究技術，提出氨基酸絡合物以與攝入時相同的分子形式被完整地吸收到血液中的觀點。Lowe 等[43]的小狗動物實驗結果支持Ashmead 等[42]的鋅以氨基酸鋅絡合物形式通過腸道腸細胞轉運并完整進入血循環的結論。Koike 等[44]通過乙二胺四乙酸鈣鈉/鋅鈉（Zn/Ca-ethylene diamine tetraacetic acid，Zn/Ca-EDTA）絡合物在雞腸道吸收實驗，推斷EDTA 與陽離子一同穿過腸黏膜，但是無法判斷EDTA 金屬絡合物通過黏膜的具體吸收情況。Wapnir 等[45]通過灌注實驗分析大鼠腸腔段中鋅含量，發現鋅-組氨酸絡合物的腸道轉運機制與組氨酸相同。

4.2 競爭吸收假說

該假說主張絡合物進入腸道后，微量元素受到配位體的保護，可以避免不利于金屬吸收的物理化學因素的影響，直達小腸刷狀緣，并在吸收位點處發生水解，以金屬離子形式進入腸上皮細胞，并被吸收入血。目前多數學者認為鋅離子是通過跨細胞途徑被機體吸收，此過程基本需要3 個步驟，1）腸腔中的鋅穿過小腸黏膜細胞頂膜進入細胞，由于細胞膜表面帶有大量負電荷，鋅離子難以通過，所以機體胰腺會分泌鋅結合蛋白與鋅離子形成絡合物，進而通過腸道絨毛轉運至上皮細胞。鋅離子進入細胞的過程由2 種鋅轉運蛋白控制。ZIP4 和ZnT5；ZIP4 被動轉運鋅離子至腸細胞刷狀緣膜上，而ZnT5 可將腸細胞中鋅離子排出細胞內，也可外排細胞質鋅，以此調節機體和細胞內的鋅穩態。2）鋅從小腸黏膜細胞頂膜到基膜的胞內轉運：進入腸細胞后的鋅主要有細胞質游離鋅、金屬硫蛋白結合鋅和儲存囊泡內的鋅3 種存在形式。3）鋅穿過小腸黏膜細胞基底膜入血轉運：鋅經基底膜上的鋅轉運蛋白入血，并與白蛋白結合轉運至全身[46-47]。

劉化偉[48]將原位結扎技術與同步輻射技術結合、證明鐵元素吸收進入腸壁特殊區域后，化學價態和配位結構均與之前相同，說明氨基酸絡合微量元素在腸壁中是以離子形式被吸收，符合競爭吸收假說。于昱[49]采用全體內法-自然飼喂法研究正常生理狀態下肉仔雞小腸中鋅的吸收特點及機理，實驗結果表明有機鋅極有可能解離成離子后，通過無機鋅的吸收途徑被吸收，同樣符合競爭吸收假說。Hempe 等[50]通過結扎大鼠十二指腸環形式，研究EDTA 和蛋氨酸鋅絡合物對大鼠腸道鋅吸收的影響，發現蛋氨酸-鋅絡合物并沒有被完全吸收，而是在吸收前發生了解離，支持競爭性吸收假說。

雖然目前已有許多實驗研究氨基酸/多肽-鋅絡合物的吸收轉運機制，但目前并沒有直接的實驗證明哪一種假說更符合肽鋅絡合物在腸道中的吸收機制。肽鋅絡合物的成鍵方式、小腸刷狀緣的水解位點等因素會對絡合物的吸收形式存在影響，各種實驗的方法、原料和操作的不同也會導致得出的結果不同，因此，日后的實驗還需要大量深入的專門研究，以尋找更加有力的吸收證明。

5 展望

鋅是動物必需的微量元素之一，與機體發育、骨骼生長、免疫機能、蛋白質和核酸代謝等有密切關系。由于機體無法生成鋅，在日常生活中除了鋅攝入量不足之外，食用含有高水平抗營養物質（如植酸鹽）的食物也會使機體對鋅的吸收產生負面影響。現階段，肽鋅絡合物作為第三代鋅補充制劑，因其化學性質穩定、吸收快、適口性好等優勢成為研究熱點，而開發出具有較好鋅結合能力的多肽和較高生物利用度的肽鋅絡合物具有良好的科學意義和現實意義。

肽鋅絡合物的結構和功能研究表明，多肽的鋅結合能力與其氨基酸組成、肽的凈電荷和肽的分子量等因素有密切的關系，其中氨基酸組成和序列占據主導作用。

目前普遍被接受的鋅離子腸道吸收途徑是跨細胞吸收，多肽的腸道吸收途徑有4 種：PepT1 介導轉運途徑、胞吞作用、細胞旁路途徑和細胞穿透途徑，而肽鋅絡合物的腸道吸收途徑仍沒有明確的解釋。大量的體內和體外研究表明，肽鋅絡合物具有增強鋅的保留、轉運和吸收的能力，是無機鋅鹽的更好替代品。然而，絡合物是通過氨基酸或多肽的途徑被完整吸收，亦或是全部或部分解離成離子后通過無機鋅離子途徑被吸收利用，以往的研究中也沒有對此做出清晰的解釋。目前大多數研究都集中于分離和鑒定鋅絡合肽、肽鋅絡合物的可利用性及其生物利用度等，其真實腸道吸收轉運機制仍缺乏證明。

未來的研究應該為肽鋅絡合物的理化性質提供更多的理論支持，包括在結合位點和主要驅動力等方面，這些研究可以促進肽鋅絡合物作為礦物鋅補充劑的商業化。同時需要探究多肽鋅絡合物在小腸上皮細胞的跨膜運輸動力學機制，進一步探究其胃腸環境穩定性和轉運特性，揭示多肽鋅絡合物的促鋅吸收機制。此外，雖然近些年關于多肽金屬絡合物的相關研究有所增加，但所有多肽的安全性尚未得到科學的證明，從實驗室到工業的轉化過程中，驗證產品能否長期安全使用也至關重要。