人冠狀動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)YKL-40、CXCL2、IFN-γ的表達及其與冠心病猝死的關(guān)系

樂翠云,萬昌武,彭 進,王 杰,張橋軍,茍 吉,夏 冰

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary heart disease, CHD)是心源性猝死中最常見的心血管系統(tǒng)疾病[1-2]。越來越多的研究顯示,CHD的發(fā)作與冠狀動脈斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān),而炎癥反應(yīng)在斑塊穩(wěn)定性中扮演重要角色[3]。YKL-40通常由組織中激活的中性粒細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞等分泌[4]。研究報道,YKL-40參與多種腫瘤組織損傷后細胞外基質(zhì)的炎癥和重塑,通過與多種炎性介質(zhì)發(fā)生聯(lián)系參與炎癥反應(yīng)[5-6]。血清YKL-40可以作為CHD早期預(yù)警的標志物之一,與動脈粥樣硬化板塊不穩(wěn)定性事件相關(guān)[7-8]。多數(shù)研究是基于動物實驗、CHD患者血管影像學(xué)觀察及血清檢驗后進行相關(guān)性分析得出結(jié)論。本文檢測人冠狀動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)YKL-40及其下游信號分子γ干擾素(interferon-γ, IFN-γ)、趨化因子配體2(chemokine ligand 2, CXCL2)的表達變化,分析三者表達水平與冠狀動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性的關(guān)系,為CHD不良預(yù)后提供臨床理論基礎(chǔ),也為法醫(yī)病理學(xué)鑒定中的心源性猝死提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 人體標本收集依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的解剖尸體規(guī)則,收集2017年12月～2021年6月貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)司法鑒定中心尸體解剖提取的人體心臟冠狀動脈組織,本實驗經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員批準,患者直系親屬均知情同意。

納入標準:(1)冷凍保存96 h內(nèi)或常溫保存48 h內(nèi)解剖的尸體;(2)CHD組為組織病理檢查明確有冠狀動脈粥樣硬化的病例,且死亡原因明確為機械性暴力且急速死亡者;(3)CHD猝死組為已明確死亡原因是CHD者;(4)對照組為同期尸檢經(jīng)證實無冠狀動脈病變,且死亡原因明確為交通事故、高墜、鈍銳器致死等急速死亡者。排除標準:(1)具有敗血癥、毒血癥等感染性疾病病例;(2)具有多器官功能衰竭及障礙的病例;(3)結(jié)構(gòu)破壞的腐敗、自溶組織病例。

1.2 案例基線資料根據(jù)是否為冠狀動脈粥樣硬化猝死分為:CHD猝死組24例,其中男性13例,女性11例,平均年齡(55.92±6.00)歲;CHD組24例,其中男性10例,女性14例,平均年齡(39.29±4.39)歲;對照組18例,其中男性11例,女性7例,平均年齡(36.17±14.89)歲。

1.3 血管組織形態(tài)學(xué)觀察及分析標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定,石蠟包埋,切片,行HE染色后于鏡下觀察冠狀動脈血管管腔橫斷面的形態(tài)。參照課題組前期的方法[9-10],采用IPP 6.0檢測冠狀動脈內(nèi)膜厚度:血管內(nèi)膜(含病灶)、纖維帽厚度、壞死灶厚度及血管腔狹窄程度,綜合評價血管的結(jié)構(gòu)改變,其中血管內(nèi)膜越厚、血管腔狹窄程度越大,提示動脈粥樣硬化的程度越重;纖維帽越薄、壞死灶越大,提示動脈粥樣硬化斑塊越不穩(wěn)定。

1.4 Western blot法檢測血管組織中YKL-40、CXCL2、IFN-γ蛋白表達量提取-80 ℃凍存的冠狀動脈血管組織蛋白,紫外分光光度計(美國Thermo公司)對蛋白進行鑒定,10%SDS-PAGE電泳,聚偏二氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜,封閉。按照YKL-40兔多克隆(稀釋比1 ∶800,美國Affinit公司)、IFN-γ兔多克隆(稀釋比1 ∶1 000,美國Affinit公司)、CXCL2兔多克隆(稀釋比1 ∶500,美國OmnimAbs公司)及β-actin兔單克隆(稀釋比1 ∶2 000,英國Abcam公司)一抗孵育過夜,辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG(稀釋比1 ∶8 000,美國Thermo公司)常溫孵育2 h,BIO-RAD曝光液顯影。以β-actin為內(nèi)參,采用Image J軟件進行條帶灰度值分析,結(jié)果為重復(fù)測量3次取平均值。

1.5 免疫組化法檢測血管病灶中YKL-40、CXCL2、IFN-γ蛋白表達及分布標本經(jīng)10%中性福爾馬林固定,常規(guī)石蠟包埋,4 μm厚切片,脫蠟,水化。加入3%H2O2,濕盒內(nèi)室溫封閉10 min,高壓熱修復(fù)抗原4 min。免疫組化采用PV 6000法,YKL-40兔多克隆(稀釋比1 ∶100)、IFN-γ兔多克隆(稀釋比1 ∶200)、CXCL2兔多克隆(稀釋比1 ∶150)為一抗,PBS緩沖液為陰性對照,4 ℃孵育過夜。PBS緩沖液沖洗后加入HRP標記的羊抗小鼠/兔IgG二抗(北京中杉金橋公司),室溫孵育45 min,DAB顯色,鏡下控制染色時間,蘇木精復(fù)染,逆濃度梯度乙醇脫水、封固。鏡下(40×)選取3個視野拍照,計算其平均光密度值(MOD值),即MOD=陽性光密度值/測量總面積。結(jié)果為重復(fù)測量3次取平均值。

2 結(jié)果

2.1 冠狀動脈血管的病理組織學(xué)變化鏡下見對照組血管管壁均勻一致,管腔無狹窄;CHD組血管壁內(nèi)膜不均勻增厚,管腔輕、中度狹窄,可見纖維帽形成;CHD猝死組血管壁偏心性增厚,血管腔嚴重狹窄,纖維帽厚薄不一,部分案例病灶內(nèi)可見鈣化、斑塊內(nèi)出血、破裂及血栓形成等繼發(fā)性改變,在病灶內(nèi)及周邊可見泡沫細胞等炎性細胞散在分布,中膜受壓萎縮變薄(圖1)。

圖1 各組冠狀動脈結(jié)構(gòu)改變:對照組.冠脈正常;CHD組.冠脈內(nèi)膜不均勻增厚;CHD猝死組.冠脈內(nèi)膜顯著增厚,或伴有斑塊內(nèi)出血等繼發(fā)病變形成

2.2 冠狀動脈病灶血管形態(tài)學(xué)指標分析圖像分析軟件測得冠狀動脈病灶血管各形態(tài)學(xué)指標并計算,結(jié)果顯示與對照組相比,CHD組和CHD猝死組內(nèi)膜厚度、纖維帽厚度、壞死灶厚度及管腔狹窄程度均升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);與CHD組相比,CHD猝死組內(nèi)膜增厚、壞死灶擴大、纖維帽厚度變薄、管腔狹窄程度增加(P<0.01,表1)。

表1 冠狀動脈病灶血管形態(tài)學(xué)相關(guān)指標分析

2.3 冠狀動脈血管組織中YKL-40、CXCL2、IFN-γ蛋白表達Western blot結(jié)果顯示,對照組、CHD組和CHD猝死組冠狀動脈血管中YKL-40、CXCL2和IFN-γ蛋白表達量呈逐漸升高趨勢,且各組間蛋白表達量兩兩相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01,圖2)。

圖2 A.Western blot法檢測各組冠狀動脈血管中YKL-40、CXCL2、IFN-γ蛋白表達;B.YKL-40相對表達量統(tǒng)計圖;C.CXCL2相對表達量統(tǒng)計圖;D.IFN-γ相對表達量統(tǒng)計圖:與對照組相比,*P<0.01;與CHD組或?qū)φ战M相比,#P<0.01

2.4 冠狀動脈病灶內(nèi)YKL-40、CXCL2、IFN-γ表達水平及分布對照組血管管壁未見YKL-40、CXCL2、IFN-γ蛋白表達,CHD組和CHD猝死組血管內(nèi)膜病灶內(nèi)可見YKL-40、CXCL2、IFN-γ表達(圖3),主要分布在病灶的肩部及基底部的泡沫細胞胞質(zhì)、胞核。對照組、CHD組、CHD猝死組中YKL-40、CXCL2、IFN-γ表達水平逐漸增高,以CHD猝死組增高更為顯著(P<0.01)。

2.5 YKL-40蛋白表達水平與冠狀動脈形態(tài)學(xué)指標的相關(guān)性將CHD組和CHD猝死組冠狀動脈內(nèi)膜病灶內(nèi)YKL-40表達的MOD值與冠狀動脈形態(tài)學(xué)指標內(nèi)膜厚度、壞死灶厚度、纖維帽厚度及管腔狹窄程度進行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示YKL-40表達的MOD值與病灶厚度、纖維帽厚度及管腔狹窄程度呈正相關(guān),與纖維帽厚度呈負相關(guān)(圖4)。

圖4 CHD組和CHD猝死組冠狀動脈內(nèi)膜病灶內(nèi)YKL-40蛋白表達MOD值與冠狀動脈形態(tài)學(xué)指標的相關(guān)性:A.YKL-40蛋白表達MOD值與冠狀動脈內(nèi)膜厚度呈正相關(guān);B.YKL-40蛋白表達MOD值與壞死灶厚度呈正相關(guān);C.YKL-40蛋白表達MOD值與纖維帽厚度呈負相關(guān);D.YKL-40蛋白表達MOD值與管腔狹窄程度呈正相關(guān)

2.6 冠狀動脈血管中YKL-40、CXCL2、IFN-γ蛋白表達水平的相關(guān)性分析相關(guān)性分析顯示,CHD組和CHD猝死組冠狀動脈內(nèi)膜病灶內(nèi)YKL-40蛋白表達MOD值與CXCL2、IFN-γ蛋白表達MOD值呈正相關(guān)(圖5)。

圖5 CHD組和CHD猝死組冠狀動脈內(nèi)膜病灶內(nèi)YKL-40、CXCL2、IFN-γ蛋白表達的相關(guān)性分析:A.YKL-40蛋白表達MOD值與CXCL2蛋白表達MOD值呈正相關(guān);B.YKL-40蛋白表達MOD值與IFN-γ蛋白表達MOD值呈正相關(guān)

3 討論

研究顯示動脈粥樣硬化晚期,斑塊內(nèi)出現(xiàn)多量炎癥細胞,同時壞死灶擴大,膠原蛋白含量降低,纖維帽變薄,導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定,最終可引起斑塊破裂和CHD不良事件發(fā)生[3]。本實驗通過檢測冠狀動脈血管結(jié)構(gòu)的相關(guān)指標,發(fā)現(xiàn)CHD患者冠狀動脈內(nèi)膜厚度普遍增厚、血管腔不同程度狹窄;對比分析CHD猝死組和CHD組的血管結(jié)構(gòu)對應(yīng)指標顯示,前者除管腔狹窄程度均更嚴重外,其病灶內(nèi)壞死灶厚度明顯大于后者,纖維帽厚度也較后者明顯變薄,與課題組前期的研究結(jié)果[9-10]較為一致,表明人冠狀動脈粥樣硬化斑塊結(jié)構(gòu)與其病灶穩(wěn)定性之間存在密切聯(lián)系,即斑塊內(nèi)壞死灶小、纖維帽厚,則斑塊穩(wěn)定性較好,此類患者不易發(fā)生CHD急性事件,反之斑塊內(nèi)壞死灶越大、纖維帽越薄,斑塊穩(wěn)定性較低,則可能因斑塊破裂、斑塊處血栓形成等極易引發(fā)CHD急性事件。

臨床檢測顯示CHD組患者血清YKL-40水平較對照組顯著增高,且YKL-40水平與冠狀動脈粥樣硬化程度具有相關(guān)性[11-12];Gong等[13]通過靶向敲低ApoE-/-小鼠YKL-40基因水平,發(fā)現(xiàn)動脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)和巨噬細胞含量減少,斑塊中膠原蛋白和平滑肌細胞含量增加。這些研究均提示YKL-40表達變化與動脈粥樣硬化的不良預(yù)后相關(guān)。本實驗通過直接檢測不同死亡原因CHD患者冠狀動脈粥樣硬化病灶內(nèi)YKL-40水平,了解YKL-40水平與病灶結(jié)構(gòu)變化的關(guān)系及其與死亡原因的可能關(guān)系。結(jié)果顯示,冠狀動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)YKL-40水平比對照組顯著增高,而CHD猝死組病灶內(nèi)YKL-40水平亦明顯高于CHD組;相關(guān)性分析顯示,病灶內(nèi)YKL-40水平和病灶結(jié)構(gòu)指標的YKL-40水平與病灶內(nèi)壞死灶厚度呈正相關(guān),與纖維帽厚度呈負相關(guān),即YKL-40水平越高,病灶壞死灶越大、纖維帽則越薄。這一結(jié)果與前述臨床研究及動物實驗結(jié)果相一致,且本實驗以人體冠狀動脈為研究對象,直接檢測病灶內(nèi)YKL-40表達水平及其與病灶結(jié)構(gòu)指標之間的關(guān)系,能更進一步證明YKL-40表達水平對人冠狀動脈病灶結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的影響,與動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定性存在相關(guān)性,并可能是CHD猝死等急性CHD事件發(fā)生的相關(guān)因素。

有研究在體外用siRNA抑制YKL-40表達,發(fā)現(xiàn)能抑制巨噬細胞表達CXCL2和MMP-9等,CXCL2是趨化因子,能夠從血液中募集單核細胞、中性粒細胞進入血管內(nèi)皮下激活炎癥體[14],激活的炎性體能誘導(dǎo)IL-1β、IL-18等炎癥介質(zhì)表達和釋放,促進動脈粥樣硬化的發(fā)展[15],而抑制CXCL2表達,可減少血管炎癥和氧化應(yīng)激,抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展[16]。另有研究顯示,YKL-40可以調(diào)節(jié)IFN-γ的表達,Li等[17]敲除YKL-40后可降低INF-γ的表達水平,過表達YKL-40可引起血清腫瘤壞死因子-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子表達水平的降低[18]。IFN-γ主要由巨噬細胞和T細胞分泌的促炎細胞因子,在高脂飲食的ApoE-/-小鼠主動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)顯著增加,并促進多種炎癥基因表達[19-20],同時,IFN-γ也可通過誘導(dǎo)泡沫細胞活化、氧自由基的形成、刺激氧化應(yīng)激的發(fā)生等進而促進動脈粥樣硬化的進程[21]。這些研究提示YKL-40對動脈粥樣硬化病灶的影響可能是通過影響CXCL2及IFN-γ來實現(xiàn)。本實驗同時檢測冠狀動脈血管及病灶內(nèi)IFN-γ和CXCL2表達水平,發(fā)現(xiàn)CHD組IFN-γ、CXCL2水平均顯著高于對照組,而CHD猝死組中兩者表達水平又明顯高于CHD組,表明人冠狀動脈病灶內(nèi)YKL-40表達與CXCL2、IFN-γ表達的關(guān)聯(lián)性,YKL-40對動脈粥樣病灶穩(wěn)定性的影響可能是通過CXCL2、IFN-γ等因子的作用來實現(xiàn)。

綜上所述,人冠狀動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)YKL-40表達水平普遍增高,但在CHD猝死案例中表達水平增高更加顯著,YKL-40高表達可引起冠狀動脈粥樣硬化病灶內(nèi)壞死灶增大、纖維帽變薄等,從而使病灶穩(wěn)定性下降,進而引起繼發(fā)病變導(dǎo)致包括猝死在內(nèi)的急性CHD事件發(fā)生,而YKL-40對粥樣硬化病灶結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性影響的可能機制是通過調(diào)節(jié)CXCL2和IFN-γ的表達來實現(xiàn)。