SMC1A基因變異致Cornelia de Lange綜合征2型雙胞胎

趙 磊,張慶華,張 釧,陳 雪,潘海瑞,郝勝菊,惠 玲

Cornelia de Lange綜合征(Cornelia de Lange syndrome, CdLS)是一種多系統(tǒng)受累的遺傳性疾病,臨床主要表現(xiàn)為特殊面容、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、四肢畸形或缺如、先天性心臟病和行為認(rèn)知障礙。根據(jù)表型差異可分為:經(jīng)典型、溫和型和擬CdLS型[1],根據(jù)致病基因不同可分為5型,分別與NIPBL、SMC1A、SMC3、RAD21、HDAC8基因相關(guān)[2]。SMC1A基因所致的CdLS 2型呈X染色體顯性遺傳,約占文獻(xiàn)報(bào)道病例的5%,男女比為1 ∶2[3-4],臨床表現(xiàn)較溫和,以行為認(rèn)知障礙為主,可伴有難治性癲癇,面部除眉毛異常外,其它表現(xiàn)輕微,年幼患兒很難依據(jù)臨床表現(xiàn)明確診斷。本文對(duì)2022年3月甘肅省婦幼保健院收治的1例雙胞胎患兒的臨床資料和家系基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析,以提高臨床醫(yī)師對(duì)該病的認(rèn)識(shí),利于后期患兒的隨訪和治療。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1基本病史 患兒系第3胎第2產(chǎn)(圖1、2),胎齡34周,因“先兆早產(chǎn),雙胎”于我院自然分娩,出生體重1 610 g,Apgar評(píng)分1 min 9分(呼吸2分、心率2分、皮膚1分、肌張力2分、反應(yīng)2分),給予清理呼吸道,5 min 10分,臍帶繞頸1周,無(wú)胎膜早破及胎盤早剝,羊水清亮。患兒出生后因早產(chǎn)伴呼吸急促,三凹征陽(yáng)性,故以“新生兒呼吸窘迫綜合征、低出生體重兒、早產(chǎn)兒”收住新生兒科,分娩前予以地塞米松6 mg/次,共2劑;硫酸鎂5 g、15 g、15 g、15 g,共4劑。單絨雙羊,患兒弟弟(圖3)系第3胎第3產(chǎn),出生體重1 260 g,與患兒情況一致,同時(shí)收住新生兒科。患兒父親28歲,姐姐7歲,均體健。患兒母親(圖4)乙肝e抗體及核心抗體陽(yáng)性,妊娠期合并高血壓、糖尿病,除眉毛濃密外無(wú)明顯異常。孕期正常體檢,孕12周NT:1.4/1.0 mm,未行唐氏篩查,孕18周四維超聲未見(jiàn)明顯異常。孕30周超聲提示宮內(nèi)妊娠,雙活胎,胎兒如孕27周+4/26周+1,A胎兒雙頂徑、頭尾、腹圍、股骨長(zhǎng)、肱骨長(zhǎng)均低于M-2SD線,羊水偏少;B胎兒均低于M-3SD線。雙胎兒臍繞頸1周,體重差異為20%。產(chǎn)前超聲提示雙胎存活,頭位,臍繞頸1周,S/D比值正常,羊水正常低值。

圖1 患兒出生時(shí)毛發(fā)濃密,眉毛呈弓形 圖2 患兒3月齡特殊面容 圖3 患兒弟弟3月齡特殊面容 圖4 患兒母親眉毛濃密,嘴唇稍薄

1.1.2體格檢查 患兒體溫36 ℃,脈搏116次/min,呼吸61次/min,SPO2:92%,血壓70/36 mmHg,頭圍28 cm,身長(zhǎng)40 cm。特殊面容:眉毛濃密,鼻梁高,鼻孔前傾,嘴唇稍薄,嘴角下斜。神志清楚,反應(yīng)良好,發(fā)育幼稚,呼吸急促,三凹征陽(yáng)性,腹稍膨隆,肌張力稍弱,關(guān)節(jié)活動(dòng)度正常,原始反射未能完全引出。患兒弟弟體溫35.8 ℃,脈搏117次/分,呼吸62次/min,SPO2:90%,血壓62/37 mmHg,頭圍27 cm,身長(zhǎng)37 cm。

1.1.4治療與隨訪 患兒及弟弟入院后完善相關(guān)檢查,予以CAPA輔助通氣、藍(lán)光治療、靜脈輸注紅細(xì)胞、補(bǔ)充磷、粒細(xì)胞集落刺激因子等對(duì)癥治療。患兒皮膚花紋樣改變,腹部膨隆,觸之軟,腸鳴音弱,腹部平片提示新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎,予以禁食水、抗感染、靜脈高營(yíng)養(yǎng)等對(duì)癥支持治療。經(jīng)上述治療后,查體患兒腹軟,腸鳴音正常,予以完全水解蛋白奶喂養(yǎng),患兒納奶可;2022年5月3日兒童保健科查體一般情況可,營(yíng)養(yǎng)不良,舌苔白,四肢肌張力高,聽(tīng)力篩查未通過(guò),眼科篩查未做。患兒弟弟精神反應(yīng)差,皮膚花紋樣改變,腹部膨隆,腸鳴音弱,予以禁食水、抗感染治療,血培養(yǎng)結(jié)果回報(bào)屎腸球菌陽(yáng)性,予以頭孢呋辛鈉抗感染治療,后腹軟腸鳴音正常,予以完全水解蛋白奶喂養(yǎng),患兒納奶可;5月16日隨訪查體:精神反應(yīng)好,一般情況可,發(fā)育良好,皮膚黏膜紅潤(rùn),四肢肌張力正常,臍痂脫落,無(wú)滲出,眼底篩查已通過(guò),聽(tīng)力篩查未通過(guò)。

1.2 方法

1.2.1標(biāo)本采集 EDTA抗凝管采集患兒、患兒父母及弟弟外周血各3 mL進(jìn)行全外顯子組測(cè)序(北京智因東方診斷公司),本研究經(jīng)甘肅省婦幼保健院倫理委員會(huì)審核通過(guò),患兒父母知情同意。

1.2.2DNA提取 使用血液基因組柱式中量提取試劑盒(康為世紀(jì)公司)提取臍血或胎兒組織基因組DNA,操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所提取DNA樣本用Qubit 2.0型熒光計(jì)及0.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)所提供的DNA樣本進(jìn)行質(zhì)檢,合格后繼續(xù)后續(xù)操作。

1.2.3文庫(kù)構(gòu)建 采用IDT公司xGen?Exome Research Panel v2.0捕獲探針與gDNA文庫(kù)序列進(jìn)行液體雜交,將目標(biāo)區(qū)域DNA片段進(jìn)行富集,構(gòu)建全外顯子文庫(kù),覆蓋人基因組中19 396個(gè)基因的編碼區(qū)及部分非編碼區(qū),捕獲區(qū)間大小51 Mb。

1.2.4測(cè)序 通過(guò)華大智造DNBSEQ-T7測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序,目標(biāo)序列測(cè)序覆蓋度≥99%,測(cè)序過(guò)程在智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心完成。

1.2.5生物信息學(xué)分析 (1)質(zhì)控:使用fastp軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,去除接頭、低質(zhì)量reads等;(2)變異檢出:使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件將測(cè)序序列與Ensemble參考基因組GRCh37/hg19比對(duì);應(yīng)用GATK軟件分析出SNP、Indel;最后根據(jù)測(cè)序深度、變異質(zhì)量對(duì)檢測(cè)到的SNP、Indel進(jìn)行過(guò)濾和篩選,從而得到高質(zhì)量可靠的變異;(3)變異注釋及預(yù)測(cè):使用自主開(kāi)發(fā)的變異注釋軟件對(duì)檢測(cè)到的高質(zhì)量變異進(jìn)行各大數(shù)據(jù)庫(kù)(如dbSNP、千人基因組、ExAC、ESP等頻率數(shù)據(jù)庫(kù)及OMIM、HGMD、ClinVar等)的關(guān)聯(lián)注釋。借助Provean、SIFT、Polyphen2-HVAR、Polyphen2-HDIV、M-Cap、Revel、Mutationtaster等蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件,篩選出對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)可能有不利影響的變異。

1.2.6Sanger測(cè)序驗(yàn)證 利用Sanger測(cè)序?qū)﹃?yáng)性位點(diǎn)進(jìn)行家系驗(yàn)證,引物通過(guò)Primer 3.0設(shè)計(jì),由蘭州天啟基因生物公司合成,SMC1A引物序列:正向5′-CATCTCCTTCTC CAGCTCATCC-3′,反向5′-CAAGCTCTCCTTTGGGTGAAAAG-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度249 bp。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃延伸1 min,合計(jì)35個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min,4 ℃短時(shí)保溫。

2 結(jié)果

通過(guò)全外顯子組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)與疾病表型相關(guān)的高度可疑變異,Sanger測(cè)序確認(rèn)變異位點(diǎn)并進(jìn)行了家系驗(yàn)證,結(jié)果顯示在SMC1A基因7號(hào)外顯子發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn):SMC1A基因(NM_006306)c.897C>G導(dǎo)致氨基酸改變p.I299M,為錯(cuò)義突變(圖5),該變異在不同物種間高度保守(圖6)。參照ACMG發(fā)布的變異解讀指南:錯(cuò)義變異位于致病熱點(diǎn)區(qū)或CCR區(qū)域(圖7)(PM1);在正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)頻率<0.000 5(PM2);GnomA D數(shù)據(jù)庫(kù)中mis_Z score≥3.09基因上的突變(PP2);兩種統(tǒng)計(jì)方法(SIFT和REVEL)預(yù)測(cè)出變異對(duì)基因(基因產(chǎn)物)有影響(PP3),該變異初步判定為可能致病,關(guān)聯(lián)疾病為CdLS 2型。

圖5 Cornelia de Lange綜合征患兒及其父母、弟弟SMC1A基因測(cè)序圖:患兒、母親及弟弟均存在SMC1A基因c.897C>G變異位點(diǎn),父親為野生型

圖6 通過(guò)UCSC數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行保守性分析:該區(qū)域序列在不同物種間高度保守

圖7 IBS軟件[5]繪制SMC1A基因錯(cuò)義變異在SMC1A蛋白結(jié)構(gòu)域上的分布

3 討論

CdLS又稱阿姆斯特丹侏儒癥,是一種罕見(jiàn)的遺傳性疾病。1933年荷蘭兒科醫(yī)師Cornelia de Lange首次對(duì)2例患兒進(jìn)行了詳細(xì)描述[6],該綜合征在活產(chǎn)兒中的發(fā)病率為1/30 000～1/10 000,多為散發(fā)病例,少數(shù)存在家族發(fā)病傾向[7]。盡管全球報(bào)道了許多病例,但國(guó)內(nèi)報(bào)道病例較少,對(duì)于一些表現(xiàn)輕度的患兒,臨床醫(yī)師很難考慮到CdLS,近年來(lái)隨著分子診斷水平的應(yīng)用,國(guó)內(nèi)許多病例被發(fā)現(xiàn)。與CdLS相關(guān)的致病基因主要包括NIPBL、SMC1A、SMC3、RAD21和HDAC8基因,隨著對(duì)該綜合征的研究和認(rèn)識(shí),一些罕見(jiàn)的基因也被考慮,但由于缺乏典型的臨床表現(xiàn),故臨床病例主要以上述5個(gè)基因多見(jiàn),NIPBL基因變異約占70%[7],臨床表現(xiàn)較典型。根據(jù)CdLS國(guó)際共識(shí)的診斷標(biāo)準(zhǔn),依據(jù)臨床表現(xiàn)也可以明確診斷,但該綜合征臨床表現(xiàn)存在差異,臨床醫(yī)師對(duì)該病認(rèn)識(shí)不足,依據(jù)臨床表現(xiàn)確診具有非常大的挑戰(zhàn)性,需通過(guò)基因檢測(cè)進(jìn)一步明確診斷以及CdLS分型。研究發(fā)現(xiàn)CdLS相關(guān)的致病基因均與黏連蛋白相關(guān),其中SMC1A基因編碼黏連蛋白的組成成分,SMC1A蛋白有4個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域,包括ATP結(jié)合位點(diǎn)、卷曲螺旋、Region域和SMC環(huán)狀結(jié)構(gòu),在DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄以及姐妹染色單體分離中起重要作用[8],與賴氨酰氧化酶樣蛋白3(lysyl oxidase like 3, LOXL3)結(jié)合維持基因組的完整性[9]。檢索HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)131個(gè)SMC1A基因變異(最后一次訪問(wèn)時(shí)間為2022年5月24日),其中剪接變異5例,移碼變異17例,缺失變異8例,框內(nèi)變異11例,錯(cuò)義變異70例,無(wú)義變異18例,同義變異2例,通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)收錄81個(gè)SMC1A基因變異與CdLS 2型相關(guān)。SMC1A基因位于Xp11.22,部分能逃逸X染色體失活,女性患者的致病原因可能是顯性負(fù)效應(yīng),與男性患者相比,女性患者從正常表現(xiàn)到致死性病變均可存在,患兒母親攜帶變異位點(diǎn)臨床表現(xiàn)卻輕微,可能與X染色體失活有關(guān)[10]。

本例患兒出生時(shí)具有CdLS典型面部特征,基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的變異位點(diǎn)SMC1A基因c.897C>G,該基因與CdLS 2型相關(guān),臨床特征包括面部畸形、手腳畸形、生長(zhǎng)延遲、認(rèn)知障礙、多毛癥、胃食管功能障礙和心臟、眼科和泌尿生殖系統(tǒng)異常。雖然目前患兒僅面部特征較典型,但考慮到患兒較小,一些癥狀尚不明顯,對(duì)于智力評(píng)估、心臟、眼科檢查需定期復(fù)查。癲癇發(fā)作在SMC1A基因變異的個(gè)體中約占45%,尤其是截?cái)嘧儺惖幕純嚎杀憩F(xiàn)為難治性癲癇和嚴(yán)重發(fā)育不良[7,11],所以對(duì)于SMC1A基因變異的患兒,腦電圖檢測(cè)也是必要的。該病臨床尚無(wú)有效的治療手段,以對(duì)癥支持治療為主,預(yù)后主要取決于并發(fā)癥的嚴(yán)重程度,積極的康復(fù)治療有助于減少并發(fā)癥,提高患兒生活質(zhì)量[12]。

總之,本文1例雙胞胎患兒SMC1A基因c.897C>G新發(fā)變異,患兒及弟弟臨床表現(xiàn)基本一致,但實(shí)驗(yàn)室檢查存在差異,檢索數(shù)據(jù)庫(kù)和查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)該變異在國(guó)內(nèi)未見(jiàn)收錄和報(bào)道,擴(kuò)大了SMC1A基因變異譜。同時(shí)對(duì)于表現(xiàn)不明顯但存在SMC1A基因變異的女性,在生育指導(dǎo)方面應(yīng)慎重,尤其當(dāng)胎兒為男孩時(shí),更應(yīng)慎重考慮胎兒的去留。目前CdLS的致病機(jī)制尚不十分明確,基因型和表型關(guān)系復(fù)雜,需進(jìn)一步研究。