全流程規范化條件下石蠟組織FISH技術檢測失敗的影響因素分析

呂君文,丁 穎,陳旭陽,李 霄,管雅潔,繆 琛,時珊珊,蔣 露,張煒明

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技術因具有檢測周期短、安全性高等優點[1],在臨床病理一線得到了廣泛應用,快速準確的FISH報告對患者的診斷及個性化治療具有重要的指導作用。在實際工作中,FISH技術全流程質控仍未實現,石蠟組織FISH檢測失敗的情況屢見不鮮。以往的研究多從組織前期處理方法和實驗條件兩個角度探討檢測失敗的影響因素[2-3],在全流程規范化操作且最優的實驗流程情況下,檢測失敗仍時有發生。本研究旨在通過分析江蘇省人民醫院病理科2018年6月～2022年4月的FISH檢測結果,通過統計學方法尋找檢測失敗的影響因素,分析其可能原因并提出解決方法,以期給廣大病理工作者提供更多參考,提高FISH檢測的一次成功率。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集江蘇省人民醫院2018年6月～2022年4月FISH檢測病例庫中所有FISH檢測報告及病例信息合計7 517例,病例信息包含FISH病理號、原病理號、姓名、標本類型、組織名稱、病理診斷、報告時間及實驗結果評價。刪除信息不全、操作條件和本院不同的會診病例,最終合計5 698例納入研究范圍。

1.2 方法標本前期處理:標本離體30 min內均采用10%中性福爾馬林固定,規范化取材,采用全自動脫水儀規范化處理組織(圖1)。實驗流程:(1)70 ℃培養箱烤片1 h;(2)室溫下二甲苯脫蠟3次×10 min;(3)室溫下無水乙醇2次×5 min;(4)室溫下85%、70%乙醇各3 min;(5)玻片沖水3 min;(6)95 ℃純水煮片20 min;(7)玻片沖水3 min;(8)37 ℃、2.5 mg/mL胃酶工作液處理10 min,可根據實際情況進行調整;(9)室溫下2×SSC液漂洗2次×5 min;(10)70%、85%、100%梯度乙醇中各脫水3 min;(11)參照金普嘉產品說明書配置探針;(12)滴加10 μL探針于組織上,封片,橡皮膠封邊;(13)變性:83 ℃ 10 min;(14)雜交:37 ℃濕盒暗處孵育過夜;(15)70 ℃、0.4×SSC洗滌2 min,37 ℃、2×SSC洗滌2 min;(16)室溫70%乙醇脫水3 min;(17)復染:滴加15 μL DAPI于組織上,封片。實驗由經驗豐富的高年資病理技師完成。由一位高年資病理醫師和一位高年資病理技師獨立閱片,診斷意見一致。以下情況視為實驗失敗:(1)未見雜交信號(圖2);(2)雜交信號弱(圖3);(3)熒光背景強,無法分析雜交信號(圖4);(4)切片過厚導致細胞核重疊,雜交信號重疊(圖5);(5)切片過薄導致信號不完整(圖6)。

圖1 FISH檢測規范化流程圖

圖2 未見雜交信號 圖3 雜交信號弱 圖4 熒光背景強 圖5 切片過厚導致細胞核重疊,雜交信號重疊 圖6 切片過薄,信號不完整 圖7 胃癌標本,非特異性吸附強

1.3 統計學分析應用SPSS 25.0軟件進行統計學分析。計數資料以例(%)表示,組間比較采用行列表χ2檢驗進行統計分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FISH檢測成功率統計分析顯示,本組5 698例FISH檢測病例中5 508例FISH檢測一次成功,成功率為96.7%;190例FISH首次檢測失敗(圖2～6),失敗率為3.3%。

2.2 不同標本來源FISH檢測結果本組病例按照標本來源分為常規組3 765例、穿刺組1 303例、快速組630例,FISH首次檢測失敗病例分別為81例(2.2%)、102例(7.8%)和7例(1.1%)(表1)。統計學分析發現三組間差異有統計學意義(χ2=107.638,P<0.001)。

表1 不同標本來源FISH檢測結果

2.3 不同組織類型FISH檢測結果本組病例根據組織類型分為乳腺組2 948例、胃腸組461例(圖7)、肺組織組119例、軟組織組541例、中樞神經系統組562例、頭頸組240例、淋巴組404例、其它組423例。FISH首次檢測失敗病例分別為28例(0.9%)、24例(5.2%)、11例(9.2%)、39例(7.2%)、26例(4.6%)、5例(2.1%)、40例(9.9%)和17例(4.0%)(表2)。統計分析發現,8組間差異具有統計學意義(χ2=153.840,P<0.001)。

表2 不同組織類型FISH檢測結果

2.4 不同蠟塊年限FISH檢測結果本組病例按照蠟塊年限分為≤2年組(5 669例)和>2年組(29例),FISH首次檢測失敗病例分別為188例(3.3%)和2例(6.9%)(表3)。統計分析發現,兩組間差異無統計學意義(χ2=1.147,P=0.284)。

表3 不同蠟塊年限FISH檢測結果

2.5 不同季節FISH檢測結果本組病例根據FISH檢測時間分為春季組(3～5月)(1 476例)、夏季組(6～8月)(1 623例)、秋季組(9～11月)(1 209例)和冬季組(12～次年2月)(1 390例)。FISH首次檢測失敗病例分別為52例(3.5%)、60例(3.7%)、39例(3.2%)和39例(2.8%)(表4)。統計分析發現,4組間差異無統計學意義(χ2=2.074,P=0.557)。

表4 不同季節FISH檢測結果

3 討論

已有研究表明組織的前期處理和實驗條件等均會直接影響石蠟組織FISH檢測成功率[2-4]。為從其他角度探究可能影響FISH檢測的影響因素,本研究通過統計學方法分析了5 698例FISH檢測結果發現,FISH檢測一次成功率為96.7%,失敗率為3.3%。該結果表明在本科室規范化的組織處理條件和最優的實驗流程下,雖然絕大部分病例FISH檢測能夠一次成功,但仍存在首次檢測失敗的情況。本文就可能影響檢測的因素進行了研究。

本研究發現不同來源標本之間FISH檢測失敗率差異有統計學意義,其中穿刺組失敗率最高。這可能與部分穿刺組織在未送至病理科前已在固定液中存放過久有關。一方面活檢穿刺標本因組織小,固定液滲透快,固定時間一般在4～6 h內,若超出6 h則可能會加劇靶序列與核蛋白的交聯程度,使得靶序列暴露困難,探針結合難度增加。另一方面文獻報道組織固定后,組織細胞釋放的胺與固定劑中的醛結合,會產生可發出熒光的希夫堿,形成背景熒光[5-6],組織固定時間過長可能會加劇背景熒光的產生。非特異熒光過強會掩蓋組織特異的熒光信號[6],信噪比降低。遇到這部分穿刺樣本,和臨床及時溝通,給固定時間“做減法”,給消化時間“做加法”是非常必要的。

組織因其自身的結構特點不同也可能影響FISH檢測結果。本研究發現不同組織類型間FISH檢測失敗率差異有統計學意義。失敗率較高的組織分別為淋巴組織、肺組織、軟組織和胃腸組織。(1)淋巴組織疾病鏡下細胞數量多,排列緊密,切片厚度應控制在2 μm,過厚則會導致細胞堆疊。日常實踐中,雖然切片機會定期校準,但蠟塊溫度、切片速度、切片壓力、刀的角度、儀器的潤滑程度均會影響切片厚度,導致成片厚度與理想厚度產生一定誤差[7]。切片過厚不僅會影響消化的效果進而影響探針結合,而且極易造成細胞聚集,影響信號判讀[8-9]。(2)切片厚薄程度對軟組織腫瘤FISH檢測也同樣重要。在脂肪瘤與脂肪肉瘤的診斷及鑒別診斷中,脂肪細胞排列稀疏、細胞間可見脂肪母細胞,其胞質內富含脂滴,呈空泡狀。若切片太薄,鏡下腫瘤細胞數量過少、核過小則會影響FISH信號的呈現[8]。此外,脂肪細胞內脂滴的存在不利于有機溶劑的滲透,尤其在溶劑反復使用后會影響脂肪組織的處理效果[10]。因此對于帶有脂肪的腫瘤,取材時可將組織取的相對薄一點,以便組織得到充分處理,有利于降低FISH檢測失敗風險。(3)一些軟組織腫瘤中存在黏液成分,如黏液型脂肪肉瘤具有明顯的黏液樣基質,黏液纖維肉瘤中含黏液等。如果消化不到位,這些黏液成分會影響探針穿透細胞核和靶序列結合,增加FISH檢測失敗風險。同樣地,某些胃腸腫瘤及肺腫瘤中,如黏液腺癌的腫瘤細胞會產生大量黏液樣物質,鏡下非特異性吸附強,嚴重干擾正常信號的判讀。本研究證明了以上觀點,本組中上述組織的失敗率均較高。針對帶有黏液的組織,可以參考HE切片尋找腫瘤細胞的位置,有針對性的消化切片,防止消化不足或消化過度。

本研究發現4個季度之間FISH檢測失敗率無明顯差異,目前尚無相關文獻報道環境溫度和濕度對FISH檢測的影響,后續需要以客觀的溫度和濕度來劃分范圍進行深入的研究。有文獻表明蠟塊經過長期保存后FISH雜交效率顯著下降[11],但本研究中不同蠟塊年限之間FISH檢測失敗率差異無統計學意義,這可能與本組年限較長的蠟塊例數較少有關,后期可擴大樣本進一步研究。

綜上,樣本的差異性對其FISH檢測成功率具有非常重要的影響,考慮不同標本來源及組織特點匹配合適的實驗處理步驟至關重要,這要求處理“個性化”標本時,應采取“精準化”的流程,也給廣大病理工作者提出了更高的要求。在實際工作中,病理技術員要積累更多的工作經驗,為全流程質控的實現提供基礎,進一步提高FISH檢測成功率。