阿利新藍和改良Hale膠體鐵黏多糖染色法在玻尿酸栓塞病理診斷中的應用

董怡銘,楊琛騰,趙國婷,張麗華,左 敏,王松軍,馬如飛,劉 霞,張國忠,2

玻尿酸又稱透明質酸、糖醛酸,是一種廣泛分布于人體各處的糖胺聚糖,由重復的二糖D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺組成[1]。目前,玻尿酸和膠原蛋白作為化妝品填充物在整形和重建手術中的應用越來越廣泛,因過量和(或)使用不當而引起的并發癥時有發生,其中腦內和肺內小動脈阻塞導致腦梗死和肺栓塞是嚴重的并發癥類型,常導致嚴重殘疾甚至死亡[2-5]。在血管腔內檢測到玻尿酸成分,對于該類死亡案例的病理學診斷具有重要意義。本文采用阿利新藍和改良Hale膠體鐵黏多糖染色法對玻尿酸進行染色,染色效果較好,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源選取河北醫科大學司法鑒定中心陰道壁注射玻尿酸引起死亡的1例肺組織標本蠟塊,同一組織塊5 μm厚連續切片后置于普通載玻片上。標本使用在尸檢時已告知,經死者家屬知情同意。

1.2 儀器設備Leica RM2135石蠟切片機;Leica HI1210展片儀;Olympus光學顯微鏡;尼康全自動顯微照相系統。

1.3 主要試劑HE染色試劑盒(G1120)、阿利新藍染色試劑盒(G1560)、改良Hale膠體鐵黏多糖染色試劑盒(G4600)均購自北京索萊寶公司。

1.4 染色方法切片60 ℃烤片40 min,常規脫蠟入水。HE染色:自來水浸泡1 min;蘇木精染液染色15 s,自來水洗去浮色;1%鹽酸乙醇分化1 s,自來水沖洗 3 min;伊紅染液染色5 s,自來水洗去浮色;梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。阿利新藍染色:Alcian酸化液浸泡3 min;Alcian染色液染色30 min,流水沖洗;核固紅染色液復染5 min,流水沖洗1 min;梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。改良Hale膠體鐵黏多糖染色:弱酸溶液浸泡5 min進行預處理;浸入新配Hale染色工作液染色50 min;弱酸溶液沖洗3次,每次2 min;新制Perls染色工作液滴染10 min,蒸餾水洗3次;Perls復染液滴染5 min,水洗;梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹膠封固。

結果判讀:利用光鏡觀察切片上的HE染色、阿利新藍染色和改良Hale膠體鐵黏多糖染色,當阿利新藍染色和改良Hale膠體鐵黏多糖染色在組織中呈藍色時為陽性。

2 結果

HE染色顯示大量不規則的嗜堿性無定形晶體物質沉積(圖1)。阿利新藍染色顯示無定形晶體物質為藍色(圖2)。改良Hale膠體鐵黏多糖染色顯示無定形晶體物質為藍色(圖3)。

①②③圖1 常規HE染色:顯示不規則的無定形晶體物質沉積,呈嗜堿性 圖2 無定性晶體物質阿利新藍染色陽性,呈藍色 圖3 無定性晶體物質改良Hale膠體鐵黏多糖染色陽性,呈藍色

3 討論

玻尿酸是由D-葡萄糖醛酸分子和由β-(1-4)和β-(1-3)糖苷連接的N-乙酰葡萄糖胺分子構成的重復單元組成的生物聚合物。它屬于一類叫黏多糖的物質,屬于糖胺聚糖家族[6]。玻尿酸可作為治療關節炎、干眼癥、皮膚潰瘍等具有確定藥理作用的產品,也可作為輔助眼科手術產品、外科手術防粘連產品、填充增加組織容積等產品,被廣泛應用于醫療領域和微整形領域。當注射玻尿酸操作不當時,玻尿酸會直接注射到血管中,或因注射過快產生壓力過大導致滲入血液循環。在血液中形成栓子,經吻合支隨血液運行至眼動脈、肺動脈或腦動脈,導致眼球萎縮、肺栓塞、腦梗死等嚴重并發癥,甚至死亡。HE染色雖然能夠很好地觀察組織的形態結構,但不能特異地顯示組織中的酸性物質。阿利新藍染色和改良Hale膠體鐵黏多糖染色可顯示組織中異常沉積的酸性黏多糖。通過HE染色結合阿利新藍染色和改良Hale膠體鐵黏多糖染色法觀察并發現血管中的玻尿酸成分,是診斷注射玻尿酸操作不當致嚴重并發癥或死亡案例的重要指標。

阿利新藍又稱愛先藍、阿爾辛藍,是一種類銅鈦花青共軛染料。這種陽離子染料的異硫脲基通過靜電與組織內的多聚陰離子相連。如含羧基和硫酸根的酸性黏液物質的羧基和硫酸根形成不溶性復合物,即染料分子中帶正電荷的鹽鍵和酸性黏液物質中帶負電荷的酸性基團結合呈藍色。膠體鐵粒子在酸性條件下也可以和酸性黏液質緊密結合形成不溶性復合物,利用普魯士藍反應使酸性黏多糖呈現藍色,改良Hale膠體鐵黏多糖染色法較阿利新藍染色法著色更深且不易被洗脫。應用阿利新藍染色法時,阿利新藍染液的pH值對實驗結果具有重要影響,當pH值為2.5時,組織內的羧基電離,帶有一個負電荷,與阿利新藍中的陽離子形成鹽鍵,對帶有羧基的組織(如透明質酸、上皮酸性黏蛋白)染色;當pH值為1.0時,組織內的硫酸根電離,帶有一個負電荷,與阿利新藍中的陽離子形成鹽鍵,使帶有硫酸根的組織(如硫酸黏液物質)染色。核固紅染色液是組織切片染色中常用的復染液,染色后細胞核呈紅色。染色液可重復使用多次,但染色效果會逐漸降低。應用改良Hale膠體鐵黏多糖染色法時,改良Hale染色液染色時間需要嚴格控制在40～60 min;且改良Hale染色液染色需要在酸性條件下進行,存放時間較長的試劑盒應用3%乙酸進行切片預處理。由于含鐵血黃素也會和Perls染液反應形成藍色沉淀,建議設置陰性對照以排除干擾。

首先對組織切片進行HE染色,觀察到血管腔內不規則的無定形晶體物質沉積,然后通過阿利新藍染色和(或)改良Hale膠體鐵黏多糖染色法確定無定形晶體物質成分。HE染色結合阿利新藍和(或)改良Hale膠體鐵黏多糖染色法能準確地檢測玻尿酸成分,且染色步驟簡便、易行,對病理診斷具有重要意義,因此在檢測玻尿酸中具有實用價值。