健脾養正消癥湯干預己糖激酶2介導的糖代謝調控胃癌細胞增殖和凋亡

商佳榮，鄭俠，錢軍

南京中醫藥大學附屬醫院，江蘇 南京 210004

胃癌是常見消化道惡性腫瘤，根據世界衛生組織數據顯示，2020年我國因胃癌死亡人數為37.4萬，居我國癌癥死亡原因第3位[1]。由于胃癌早期癥狀不明顯，確診時多為晚期甚至發生轉移，五年生存率約35.1%[2]。近年來，內鏡檢查、手術、放化療、免疫和靶向治療在胃癌中取得了突破，然而依然存在復發轉移率高、藥物耐受性等難題，嚴重影響患者的生存和生活質量。因此，探索高效低毒的藥物和精準靶點，提高胃癌治療的療效和安全性具有重要意義。

胃癌的發展與細胞能量代謝關系密切，胃癌細胞通過調節葡萄糖攝取、乳酸生成等代謝途徑，為其增殖、侵襲、轉移及逃逸等創造有利條件，有助于其在腫瘤進展期間無限增殖和存活。胃癌細胞在惡性轉化的過程中，細胞的代謝模式從氧化磷酸化轉化為糖酵解以滿足更多的能量需求[3]。己糖激酶是糖酵解過程的第一個限速酶，可磷酸化己糖變為己糖-6-磷酸。已知的己糖激酶有4種（HK1～HK4），其中己糖激酶2（HK2）在很多和有氧糖酵解增強有關的腫瘤中表達上調[4]。HK2可加速胃癌細胞對葡萄糖的攝取，促進糖代謝，進而促進癌細胞的增殖和腫瘤進展[5]。因此，抑制胃癌糖代謝途徑相關基因、蛋白表達及通路激活，可能是抑制胃癌腫瘤細胞進展的關鍵。

中醫藥治療胃癌等惡性腫瘤不僅能顯著改善臨床癥狀，直接發揮抗癌作用，還能聯合手術、放化療、靶向及免疫治療等發揮增效減毒作用。首屆全國名中醫劉沈林教授針對胃癌治療，在汲取前人經驗基礎上，通過長期臨床實踐總結，提出“脾虛正衰是病機關鍵，癌毒是重要病理因素”，并由《何氏虛勞心傳》健脾資生丸及《沈氏尊生書》血癥丸化裁而成健脾養正消癥湯[6]。臨床試驗顯示，健脾養正消癥湯可顯著延長胃癌晚期患者生存期，提高其生活質量[7]。然而，對于健脾養正消癥湯治療胃癌的具體分子生物學機制尚未完全闡明。本研究通過網絡藥理學方法及實驗驗證，探索健脾養正消癥湯通過影響糖代謝途徑治療胃癌的分子生物學作用機制，為健脾養正消癥湯的開發和臨床應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學分析

1.1.1 健脾養正消癥湯有效成分及靶點獲取

通過TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索健脾養正消癥湯11味組方藥物“黃芪”“黨參”“白術”“當歸”“白芍”“陳皮”“三棱”“莪術”“石見穿”“白花蛇舌草”“甘草”的活性成分，以類藥性（DL）≥0.18且口服生物利用度（OB）≥30%的化合物作為健脾養正消癥湯有效活性成分，同時收集和整理活性成分對應的靶點。將所得活性成分輸入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），下載化學成分標準化格式的SMILES號，并將其輸入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）平臺進行靶點預測。根據UniProt（https://www.uniprot.org）數據庫對靶點信息進行比對、校正，將SwissTargetPrediction和TCMSP靶點合并、去重，獲得活性成分靶點，構建健脾養正消癥湯活性成分靶點數據庫。

1.1.2 胃癌糖代謝相關靶點檢索

以檢索表達式“glycometabolism” AND“gastric cancer”，在GeneCards（https://www.genecards.org/）數據庫檢索相關疾病靶點，以Relevance score＞1為標準選取疾病靶點，比對UniProt數據庫，構建疾病相關靶點數據庫。利用Venny（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）映射疾病靶點與健脾養正消癥湯活性成分靶點的交集。

1.1.3 中藥-活性成分-靶點網絡構建

將交集靶點數據導入Cytoscape3.9.1軟件（https://cytoscape.org/），構建中藥-活性成分-靶點網絡，以直觀展現藥物活性成分與疾病間相互關系。利用CytoNCA插件對該網絡進行拓撲分析，計算節點的度中心性（degree centrality，DC）、中介中心性（betweenness centrality，BC）和接近中心性（closeness centrality，CC）。網絡中節點的值越大，相互作用關系就越多，越可能為該網絡的關鍵節點。

1.1.4 蛋白相互作用網絡構建

基于STRING（https://string-db.org/）數據庫獲取潛在靶點蛋白相互作用（PPI）關系，設定物種為“Homo Sapiens”（人類），篩選并構建PPI網絡。借助Cytoscape對PPI網絡進行挖掘分析，基于CytoNCA插件計算PPI網絡中各節點的DC、BC、CC進行拓撲分析，選取DC、BC、CC值均高于中位數的靶點作為核心靶點。

1.1.5 GO、KEGG及DO富集分析

運用RStudio軟件包ggplot2、clusterProfiler、enrichplot、org.Hs.eg.db、ggnewscale、pathview對健脾養正消癥湯干預胃癌糖代謝的潛在靶點進行GO、KEGG和DO富集分析。以P＜0.05為條件進行篩選，得到健脾養正消癥湯干預胃癌糖代謝的主要功能、通路及相關疾病，并對結果進行可視化處理。

1.1.6 分子對接

借助PubChem數據庫，查找健脾養正消癥湯主要活性成分的3D結構，輸入OpenBabel3.1.1（http://openbabel.org/），保存為mol2格式。依據RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）數據庫，查找核心靶點的蛋白晶體結構，利用PyMOL（https://pymol.org/）軟件對其進行去水、加氫，并輸出為pdb格式。最后使用Autodock Tools（https://autodock.scripps.edu/）軟件進行分子對接分析。

1.2 細胞實驗驗證

1.2.1 動物、試藥與儀器

SPF級SD雄性大鼠16只，8～10周齡，體質量（200±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2012-0001。于溫度（20±2）℃、濕度50%±10%、12 h/12 h光暗循環條件下，適應性飼養7 d后開始實驗。人胃癌細胞HGC-27、AGS，購于中國科學院上海細胞庫，南京中醫藥大學附屬醫院中心實驗室常規培養于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素溶液的RPMI-1640完全培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中，取對數期細胞進行實驗。動物實驗經南京中醫藥大學附屬醫院倫理委員會審批（2020NL-107-1）。

健脾養正消癥湯（黨參30 g，黃芪60 g，麩炒白術10 g，炒白芍10 g，當歸10 g，石見穿15 g，三棱30 g，莪術30 g，白花蛇舌草15 g，陳皮6 g，甘草5 g）飲片購于南京中醫藥大學附屬醫院，加10倍量水常規煎煮，重復煎煮2次，所得藥液混合、過濾、滅菌、蒸發、濃縮，使其終濃度為1 g/mL，置于-20 ℃冰箱保存備用。

10%胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司，批號20010401；1%青-鏈霉素溶液的RPMI-1640培養基，賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號分別為2085154、2240832。葡萄糖測定試劑盒，上海榮盛生物藥業有限公司，批號20181209290；乳酸測定試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20190603；HK2抗體，美國Proteintech公司，批號66287-1-lg；二抗，北京中杉金橋生物技術有限公司，批號134293。

1300A2型生物安全柜（美國Thermo公司），IX51型倒置顯微鏡（日本Olympus公司），ELx800型全自動酶標儀（美國BioTek公司），C6流式細胞儀（美國BD公司），PowerPacTMBasic型電泳儀及轉膜儀（美國Bio-Rad公司），Tanon-5500型化學發光凝膠成像儀（中國天能科技有限公司），HERAcell 1501型CO2培養箱（美國Thermo公司）。

1.2.2 含藥血清制備

將16只大鼠隨機分為含藥血清組和對照血清組。依據預實驗結果，根據體表面積計算給藥劑量，含藥血清組予23.02 g/kg健脾養正消癥湯灌胃，對照血清組予0.9%氯化鈉注射液4 mL灌胃，每日2次，連續3 d。第4日禁食不禁水12 h，一次性灌胃全天劑量后1 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉，腹主動脈取血，37 ℃靜置4 h，2 000 r/min離心15 min，分離血清，混合同組血清后，0.22 μm醋酸纖維素膜過濾2次，56 ℃水浴30 min，-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 細胞分組

將HGC-27、AGS細胞分別分為含藥血清組（79%RPMI-1640培養基+20%大鼠含藥血清+1%青-鏈霉素）和對照血清組（79%RPMI-1640培養基+20%大鼠對照血清+1%青-鏈霉素）。每組設置3個重復，將細胞置于無血清培養基中培養2 h后再進行后續處理。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數生長期HGC-27、AGS細胞接種至6孔板，根據不同分組采用相應培養基作用48 h，收集HGC-27、AGS細胞，加70%乙醇4 ℃固定過夜；PBS沖洗2次，加入RNase，37 ℃水浴30 min；PBS再次洗滌2次后，加入碘化丙啶（PI），4 ℃避光染色30 min，400目濾網過濾1次，1 000 r/min離心5 min，棄去PBS，流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.5 糖酵解水平檢測

HGC-27、AGS細胞根據不同分組采用相應培養基作用48 h，收集HGC-27、AGS細胞，8 000 r/min離心10 min，收集上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液-20 ℃冰箱保存備用。按葡萄糖檢測試劑盒（葡萄糖氧化酶法）、乳酸檢測試劑盒說明書檢測細胞葡萄糖攝取量、乳酸生成量。

1.2.6 Western blot檢測己糖激酶2蛋白表達水平

HGC-27、AGS細胞根據不同分組采用相應培養基作用48 h，加RIPA，于冰上裂解20 min，13 000 r/min離心5 min，吸取上清液，采用蛋白質定量試劑盒（BCA法）測定蛋白濃度。取適量蛋白制膠上樣，凝膠電泳，轉膜，脫脂奶粉的Tris緩沖液封閉。2 h后用PBS清洗3次，加入稀釋后的一抗（1∶1 000），4 ℃搖床孵育過夜。棄一抗液，PBS清洗膜后，加入二抗（1∶6 000），室溫下振蕩孵育1 h。清洗膜后，加入ECL液顯影，使用凝膠成像系統顯影拍照。以Actin為參照，采用Image J軟件分析灰度值，計算蛋白相對表達量。

1.2.7 統計學方法

采用SPSS22.0統計軟件進行分析。計量資料以表示，滿足正態分布時，2組間比較采用t檢驗或非參數檢驗，多組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 網絡藥理學分析結果

2.1.1 健脾養正消癥湯活性成分及靶點

共收集健脾養正消癥湯的活性成分181種，其中黃芪20種、黨參24種、白術7種、當歸2種、白芍13種、陳皮5種、三棱5種、莪術3種、石見穿3種、白花蛇舌草7種、甘草92種。共得到藥物活性成分靶點4 094個，其中黃芪615個、黨參511個、白術249個、當歸96個、白芍316個、陳皮223個、三棱181個、莪術157個、石見穿290個、白花蛇舌草444個、甘草1 012個，剔除重復后獲得1 179個靶點。

2.1.2 胃癌糖代謝相關靶點

通過GenCards數據庫檢索與篩選，共獲得176個疾病相關靶點，對疾病與藥物靶點映射后，選取潛在作用靶點37個。經靶點比對，獲得124個活性成分，建立中藥成分與靶點關系。

2.1.3 中藥-活性成分-靶點網絡

借助Cytoscape3.9.1構建中藥-活性成分-靶點網絡，并應用CytoNCA插件對該網絡進行拓撲分析，得到DC中位數為3，BC中位數為44.577 09，CC中位數為0.407 714，三者均大于中位數的節點被認為是該網絡的關鍵節點，前20個節點見表1。健脾養正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑主要活性成分見表2。對關鍵節點中的活性成分構建中藥-活性成分-靶點網絡，該網絡由149個節點和402條邊組成，見圖1。

圖1 健脾養正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑中藥-活性成分-靶點網絡

表2 健脾養正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑活性成分

2.1.4 核心基因互作網絡

通過STRING對37個潛在基因構建PPI關系，經Cytoscape3.9.1處理，結果見圖2。利用Cytoscape軟件對PPI網絡進行拓撲分析，其中BC、CC、DC均大于其中位數的基因共14個，見表3。其中GAPDH、HIF1A、HSP90AA1、ALB、EGFR、HSPA5、PPARG、SLC2A1、HK2等具有較多的互作關系，選取為核心基因進一步研究靶點的功能。

圖2 健脾養正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑靶點PPI網絡

表3 健脾養正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑核心靶點

2.1.5 富集分析結果

通過R語言對健脾養正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑的37個潛在靶點進行GO、KEGG和DO富集分析。GO富集分析得到1 016條結果，其中生物過程（BP）900條、細胞組成（CC）63條、分子功能（MF）113條，主要包括前體代謝物和能量的產生、對營養水平的反應、對細胞外刺激的反應、NADP代謝過程等生物過程，囊泡腔、內質網腔、黑色素體、內質網伴侶復合體等細胞組成，NADP結合、泛素蛋白連接酶結合、ATP水解活性等分子功能。見圖3。KEGG通路富集分析得到46條通路，前20條通路見圖4，其中碳代謝、HIF-1信號通路、糖酵解/糖異生、脂質和動脈粥樣硬化、癌癥中的中心碳代謝等通路與健脾養正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑密切相關。DO富集分析得到200個條目，包括胃癌在內的多種癌癥，前20個條目見圖5。

圖3 健脾養正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑靶點GO富集分析

圖4 健脾養正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑靶點KEGG通路富集分析

圖5 健脾養正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑靶點DO富集分析

2.1.6 分子對接

選取3個主要活性成分槲皮素（MOL000098）、柚皮素（MOL004328）、光甘草定（MOL004908）與10個顯著表達的基因GAPDH、HIF1A、HSP90AA1、ALB、EGFR、HSPA5、PPARG、SLC2A1、HK2、PGK1進行分子對接模擬，結果見圖6。通常認為，結合能＜0 kcal/mol則小分子配體和受體蛋白能夠自發結合，結合能＜-5.0 kcal/mol表明結合活性良好[8]。對接結果顯示，健脾養正消癥湯主要活性成分與靶點均可以自發結合，平均最低結合能為-7.36 kcal/mol。其中HK2、EGFR與活性成分結合能最低，其對接模式見圖7。

圖6 健脾養正消癥湯主要活性成分與核心靶點對接結合能熱圖

圖7 健脾養正消癥方主要活性成分與靶點分子對接模式

2.2 細胞實驗結果

2.2.1 健脾養正消癥湯對HGC-27、AGS細胞凋亡的影響

與對照血清組比較，含藥血清組細胞凋亡率均明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見圖8。

圖8 2組HGC-27、AGS細胞凋亡率比較（）

2.2.2 健脾養正消癥湯對HGC-27、AGS細胞己糖激酶2蛋白表達的影響

與對照血清組比較，含藥血清組HGC-27、AGS細胞HK2蛋白表達明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見圖9。

圖9 2組HGC-27、AGS細胞HK2蛋白表達比較（）

2.2.3 健脾養正消癥湯對HGC-27、AGS細胞有氧糖酵解水平的影響

與對照血清組比較，含藥血清組HGC-27、AGS細胞葡萄糖攝取量明顯減少（P＜0.05），乳酸生成量明顯減少（P＜0.01）。見圖10。

圖10 2組HGC-27、AGS細胞有氧糖酵解水平比較（）

3 討論

胃癌以本虛標實、虛實夾雜為主要病機，“本虛”以脾胃虛弱，“標實”以水濕、痰濁、瘀血與癌毒邪氣搏結而積聚成塊[9]。胃癌細胞的能量代謝與其生長、增殖、侵襲、上皮-間質轉化等惡性生物學過程密切相關，腫瘤細胞在快速生長過程中過度消耗機體內能量，加重機體氣血缺乏、正氣不足的病理狀態。機體局部氣血阻滯，血脈不暢，氧氣和營養物質匱乏，促進腫瘤細胞糖酵解的產生。健脾養正消癥湯正是依據脾氣虛損之“本虛”和癥瘕積聚之“標實”病機立方，由黃芪、黨參、麩炒白術、莪術、三棱、石見穿等11味中藥組成，諸藥并用，可扶正健脾益氣以補中氣、養營血，兼顧行氣滯、利濕濁、消癥結、解癌毒功效。

網絡藥理學結果顯示，槲皮素、柚皮素、光甘草定、山柰酚等為健脾養正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑發揮作用的有效成分。槲皮素、柚皮素、光甘草定、山柰酚均為具有活性的黃酮類化合物，對腫瘤細胞能量代謝有一定調控作用。槲皮素可通過靶向葡萄糖代謝所需關鍵酶來減少糖酵解[10]，如槲皮素通過抑制己糖激酶表達，促使腫瘤細胞的糖酵解程序陷入紊亂，誘發凋亡信號通路，促進腫瘤凋亡[11]。光甘草定作為黃酮類化合物，也可以減少葡萄糖攝取、抑制糖酵解、下調HK2和乳酸脫氫酶A表達[12]。有研究發現，光甘草定能夠抑制糖酵解途徑而調控腫瘤細胞的能量代謝，通過抑制葡萄糖轉運子1蛋白表達減少MDA-MB-231細胞對葡萄糖的攝入，降低細胞內ATP水平、乳酸脫氫酶活性、乳酸濃度[13]。山柰酚抑制HK2和電壓依賴性陰離子通道蛋白1的線粒體結合而削弱有氧糖酵解，對抗腫瘤細胞轉移[14]，同時靶向相關基因和通路干預腫瘤細胞的糖酵解[15-16]，從而起到抗腫瘤作用。

KEGG富集分析所涉及的通路有碳代謝、HIF-1信號通路、糖酵解/糖異生、脂質和動脈粥樣硬化、癌癥中的中心碳代謝通路。碳細胞在惡性轉化過程中需要特異性的新陳代謝途徑來維持成長和生存，包括糖酵解、失調的三羧酸循環和戊糖磷酸途徑等[17]。碳代謝信號通路和癌癥中的中心碳代謝通路可以影響腫瘤至關重要的代謝網絡，在腫瘤發生、轉移和對治療的抗性中起著關鍵作用[18]。糖酵解/糖原異生是腫瘤細胞能量代謝的主要途徑，腫瘤細胞優先利用糖酵解產生能量，通過影響糖酵解途徑可以抑制腫瘤細胞的生長[19]。HIF-1信號通路在控制腫瘤對缺氧的反應中起著重要作用，通過HIF-1轉錄因子實現葡萄糖代謝的重新編程。可見健脾養正消癥湯可通過干預腫瘤代謝途徑起到治療胃癌的作用。

本研究得到健脾養正消癥湯作用于胃癌糖代謝途徑關鍵靶點有GAPDH、HIF1A、HSP90AA1、ALB、EGFR、HSPA5、PPARG、SLC2A1、HK2、PGK1。分子對接結果顯示，健脾養正消癥湯有效活性成分和靶點蛋白的結合性能良好，其中HK2與活性成分具有較強的結合活性。己糖激酶在糖酵解中起到至關重要的作用，其中同工酶HK2與腫瘤細胞的能量代謝緊密相關，對糖酵解過程起到調控作用，在多種癌細胞中呈現過表達，參與了腫瘤發生發展甚至轉移過程[20-22]。HK2作為糖酵解中的限速酶，其表達量及活性增加為腫瘤組織的生物學過程提供了足夠的能源[23-24]。胃癌腫瘤細胞中具有異常活躍的能量代謝，通過異常的糖代謝過程來逃避正常的細胞凋亡程序，增強癌細胞增殖和遷移能力，其反應過程受到HK2的影響。已有實驗表明，多種中藥成分可通過降低胃癌細胞HK2表達，減少細胞葡萄糖消耗和乳酸產生，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡[25]。本研究細胞實驗發現，健脾養正消癥湯干預胃癌細胞后，胃癌細胞凋亡率明顯升高，胃癌細胞葡萄糖消耗率及乳酸產量均明顯降低，同時，Western blot結果顯示，HK2蛋白表達受到抑制。因此，證明健脾養正消癥方能夠在體外抑制胃癌細胞的有氧糖酵解水平，促進胃癌細胞凋亡。

綜上所述，通過網絡藥理分析發現健脾養正消癥湯有效活性成分可作用于HK2靶點蛋白，干預胃癌細胞糖代謝過程，并通過細胞實驗進行驗證。本研究中健脾養正消癥湯展現對胃癌細胞增殖的抑制效果，表明胃癌患者聯用中藥干預有助于減緩腫瘤的增長速率，從而使其臨床進一步獲益。本實驗僅針對HK2靶點蛋白表達進行了驗證，沒有進一步研究健脾養正消癥湯干預HK2的具體通路及其他相關蛋白表達情況，存在一定局限性。通過網絡藥理學分析得到健脾養正消癥湯干預胃癌糖代謝途徑的多個靶點及通路，后續將在本研究基礎上進一步拓展健脾養正消癥湯干預腫瘤糖代謝治療胃癌的機制研究。