不同濃度PM2.5 對小鼠肺泡II 型上皮細胞MLE-12 的損傷作用及SP-B表達影響

李本，彭倩，高永峰，肖瑤，陳紀濤，劉季芳

廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院 廣州市加速康復腹部外科重點實驗室，廣州 510700

近年，隨著全球城市霧霾水平上升，空氣污染對人類健康的影響正引起全球關注［1］。PM2.5是空氣動力學粒徑≤2.5 μm 的顆粒物［2］，成分復雜，其中包括多種致癌成分如重金屬、多環(huán)芳烴（PAHs）、未燃燒或未完全燃燒的燃料等［3-4］。PM2.5的危害存在于多方面，其中在呼吸系統(tǒng)上，長期暴露于高濃度PM2.5環(huán)境的人群會增加5 至15 年內慢性肺部疾病的發(fā)病率和死亡率［5-6］。有研究表明，PM2.5對肺泡上皮細胞有明顯毒性作用，能導致細胞結構改變、活性明顯下降［7］。25～100 μg/mL PM2.5暴露顯著增加了肺泡上皮細胞的ROS 水平，且呈劑量依賴性［8］。肺表面活性物質（PS）是由肺泡II 型上皮細胞合成并分泌的一種脂蛋白復合物，包括二棕櫚酰卵磷脂（DPPC）和肺表面活性蛋白（SP）［9］。SP 包括SP-A、SP-B、SP-C 和SP-D，其中SP-B 主要功能為降低肺表面張力，從而防止肺泡坍塌［10］。小鼠體內實驗發(fā)現(xiàn)，氣管內滴注外源性SP-B 可改善內毒素所誘導的急性肺損傷［11］。體外研究還發(fā)現(xiàn)，高濃度PM1可引起肺泡上皮細胞氧化損傷和自噬，并抑制SP-B 和SP-C 的表達［12］。然而，關于PM2.5對SP-B 表達的影響目前尚未見報道。2021 年9 月—2022 年5 月，本研究觀察了不同濃度PM2.5作用后正常小鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞MLE-12 形態(tài)、超微結構和增殖能力變化及SP-B 水平的變化，為PM2.5致肺泡上皮細胞損傷的潛在作用機制提供一定的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、PM2.5、試劑及儀器 肺泡Ⅱ型上皮細胞MLE-12 細胞株購自中國上海科學院細胞庫。PM2.5購自美國國家標準與技術研究所，胰蛋白酶購自美國Sigma 公司，DMEM 培養(yǎng)基購自美國Gibco 公司，SP-B 抗體購自美國SANTA CRUZ 公司，GAPDH 抗體購自美國CST 公司，RNA 快速提取試劑盒購自美國ESscience 公司，qRT-PCR 試劑盒購自美國Takara公司，超聲波細胞破碎儀購自寧波新芝生物科技公司，倒置光學顯微鏡購自美國OLYMPUS 公司，透射電子顯微鏡購自日本HITACHI 公司，凝膠成像系統(tǒng)、分光光度計購自美國Bio-Rad 公司，熒光定量PCR儀購自美國Invitrogen公司。

1.2 MLE-12 細胞培養(yǎng)、分組及PM2.5混懸液加入將MLE-12 細胞接種至含10%胎牛血清、1%青—鏈霉素的DMEM 完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞貼壁生長至80%后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗2 遍加入胰酶消化至在顯微鏡下能觀察到大部分貼壁細胞變圓并脫落，接著加入培養(yǎng)基終止消化并傳代培養(yǎng)，取以對數(shù)生長的細胞用于實驗。將細胞分為實驗組和對照組，實驗組分別用加入12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5混懸液的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，PM2.5劑量選擇的主要依據(jù)為課題組前期預實驗的結果以及多徑顆粒劑量法（MPPD）模型軟件計算出的PM2.5環(huán)境暴露24 h后在氣管—支氣管上皮表面的沉積濃度［13-14］；對照組用DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.3 細胞形態(tài)及超微結構觀察 將不同濃度PM2.5溶液處理的實驗組和對照組細胞培養(yǎng)24 h 后，利用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化；不同濃度PM2.5溶液處理的實驗組和對照組細胞培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)液，使用0.25%胰酶消化細胞2 min，接著加入培養(yǎng)液轉移至離心管以1 000 r/min 的轉速離心5 min。離心完畢后棄去培養(yǎng)液，沿離心管壁緩慢加滿電鏡固定液。在4 ℃下固定15 min 后制片，采用透射電鏡觀察細胞超微結構變化。

1.4 細胞增殖能力觀察 將對數(shù)生長期的實驗組和對照組細胞按1×104/mL 接種至16 孔的細胞培養(yǎng)板中，在室溫超凈臺內放置30 min，然后放入預先擺放于培養(yǎng)箱中的RTCA 分析儀上，進行實時動態(tài)的細胞增殖檢測。次日棄掉原培養(yǎng)基，實驗組依次加入含不同濃度PM2.5的DMEM 完全培養(yǎng)基，對照組僅加入DMEM 完全培養(yǎng)基，各組設置3個復孔。利用RTCA 分析儀記錄細胞48 h 內的增殖曲線。

1.5 細胞SP-B 蛋白檢測 采用Western blotting法。分別用加入0（對照）、12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5的培養(yǎng)基培養(yǎng)MLE-12細胞24 h，將細胞用蛋白酶和磷酸酶抑制劑在冷RIPA 緩沖液中裂解，用BCA 檢測試劑盒測蛋白濃度。蛋白質樣品在99 ℃下進行10 min 的變性，下一步在12% SDSPAGE 凝膠上對蛋白進行分離，接著將其轉移到PVDF 膜上。用50 mL 含5%脫脂奶粉的TBST 在室溫下進行2 h 封閉，然后分別與GAPDH、SP-B 一抗（1∶1 000）4 ℃共同孵育過夜。用TBST 進行3 次洗滌，每次洗滌10 min，將其放置于室溫下二抗孵育1 h 后，再次使用TBST 洗滌3 次，每次洗滌10 min，最后借助Image Lab 軟件進行顯影曝光。曝光結果利用Image J 軟件分析條帶灰度值，以SP-B 條帶與GAPDH 條帶灰度比值作為SP-B 蛋白的相對表達量。

1.6 細胞SP-B mRNA 檢測 采用qRT-PCR 法。課題組前期應用轉錄組測序技術分析了0、25、100 μg/mL PM2.5對細胞化學致癌通路的影響，發(fā)現(xiàn)100 μg/mL PM2.5能減弱谷胱甘肽S-轉移酶的解毒功能 而 影 響 化 學 致 癌 通 路［13］。 因 此 用0、25、100 μg/mL PM2.5的培養(yǎng)基培養(yǎng)MLE-12細胞24 h，按照RNA 快速提取試劑盒說明書分別進行RNA 的提取。依照PrimeScriptTMRT 試劑盒說明書合成cDNA。將引物稀釋后，混勻TB Green Premix Ex TaqⅡ、PCR Forward Primer、PCR Reverse Primer、ROX Reference Dye II 和cDNA 配 成PCR 反 應 液，使 用qPCR 儀進行實時定量PCR 擴增，在PCR 系統(tǒng)上設置組別，實驗參數(shù)：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 34 s，循環(huán)40 次。儀器運行結束后將結果以Excel 表格方式導出，以GAPDH 作為內參，根據(jù)2-ΔΔCt公式計算SP-B mRNA 的相對表達水平。引物序列：SFTPB上游為5'-CTATCACGTCGGCCTCATCC-3'，下游為3'-TGGCACAGGT-CATTAG-CTCC-5'；GAPDH 上游 為5'-GGTCCCAGCTTAGGTTCATCA-3'，下 游為3'-CCAATACGGCCAA-ATCCGTTC-5'。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。服從正態(tài)分布且方差齊性的計量資料以±s表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步組間比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PM2.5作用后MLE-12 細胞的形態(tài)、超微結構及增殖能力變化 ①各組MLE-12 細胞形態(tài)變化：對照組細胞生長狀態(tài)良好；實驗組中觀察到隨著PM2.5濃度的升高細胞逐漸變得皺縮呈扁圓型，部分細胞形態(tài)不規(guī)則、背景顏色加深，可見PM2.5顆粒和吸附了顆粒的細胞，見圖1。②各組MLE-12 細胞超微結構變化：對照組細胞中觀察到了正常的超微結構；實驗組細胞中發(fā)現(xiàn)了自噬溶酶體，出現(xiàn)板層小體損傷、線粒體腫脹、線粒體嵴斷裂甚至空泡化和內質網(wǎng)擴張等細胞器損傷現(xiàn)象，損傷的嚴重程度隨著PM2.5濃度的升高而增加，見圖2。③各組MLE-12細胞增殖能力變化：0、12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5作用24 h后細胞增 殖 指 數(shù) 分 別 為0.005 2、-0.022 9、-0.031 1、-0.042 0、-0.070 4、-0.106 5，呈明顯的濃度效應關系（R2= 0.936 4）；作用48 h 后細胞增殖指數(shù)分別為-0.028 6、-0.050 6、-0.066 9、-0.069 7、-0.108 6、-0.156 8，呈明顯的濃度效應關系（R2= 0.966 4）。其中200 μg/mL PM2.5作用后細胞抑制程度最顯著，其細胞增殖指數(shù)沒有上升期，一直呈下降趨勢。

圖1 光學顯微鏡下對照組及實驗組MLE-12細胞形態(tài)

2.2 PM2.5作用后MLE-12 細胞SP-B 蛋白及mRNA相對表達量 0、12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5作用后，細胞SP-B 蛋白相對表達量分別為1、0.902 ± 0.136、0.819 ± 0.173、0.727 ± 0.191、0.602 ± 0.138、0.644 ± 0.112。與0 μg/mL PM2.5相比，12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5作用后細胞SP-B 蛋白相對表達量均降低，且具明顯的濃度效應關系（R2= 0.637 4），其中50、100、200 μg/mL PM2.5作用后細胞SP-B 蛋白相對表達量降低差異有統(tǒng)計學意義（P均< 0.05）；0、25、100 μg/mL PM2.5作用后，細 胞SP-B mRNA 分 別 為1、0.623 ± 0.153、0.590 ± 0.087。 與0 μg/mL PM2.5相 比，25、100 μg/mL PM2.5作用后細胞SP-B mRNA 相對表達量均降低，且具明顯的濃度效應關系（R2= 0.553 2，P均< 0.05），以100 μg/mL PM2.5作用后降低更為顯著。

3 討論

PM，又稱為顆粒物，指空氣中分散的固體、液體懸浮物或固液混合微粒，根據(jù)其在肺中的沉積部位可分為粗顆粒物（PM10）和細顆粒物（PM2.5）［15］。最新發(fā)布的2022 年世衛(wèi)組織年度報告顯示，PM2.5暴露對人類健康構成了巨大威脅［16-17］。據(jù)全球疾病負擔研究估計，環(huán)境PM2.5是全球第五大最重要的死亡危險因素［18］，2017 年全球290 萬人的死亡可歸因于室外PM2.5污染［19］。先前的流行病學研究表明，PM2.5暴露與多種呼吸道疾病（如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病和肺癌）之間的關系已得到證實［20］。PM2.5進入呼吸道后，其有毒成分能夠引起肺組織炎癥細胞浸潤，增加炎癥因子表達水平，誘導肺泡上皮細胞凋亡以及肺超微結構改變［21-22］。因此，我們有必要進一步探究PM2.5對機體的毒性作用。

肺泡Ⅱ型上皮細胞的正常功能對維持肺泡結構和功能及局部環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用，其功能狀態(tài)的改變被認為與多種肺損傷及肺部疾病的發(fā)生有關［23］。本研究首次在12.5、25、50、100、200 μg/mL PM2.5的染毒梯度下，采用光學顯微鏡觀察正常肺泡Ⅱ型上皮細胞MLE-12 形態(tài)，透射電鏡觀察細胞超微結構，RTCA 儀檢測細胞增殖能力，發(fā)現(xiàn)PM2.5可呈劑量依賴性損傷細胞形態(tài)和超微結構、抑制其增殖，表明PM2.5對MLE-12細胞具有一定的毒性作用。我們課題組的前期研究結果還發(fā)現(xiàn)PM2.5可促進肺泡上皮細胞的遷移、侵襲、上皮間質轉化和激活化學致癌通路相關基因，提示PM2.5能促進細胞惡性轉化，有潛在的致癌作用。然而，PM2.5致毒性的分子機制目前尚未完全闡明。

SP 在肺泡Ⅱ型上皮細胞的內質網(wǎng)（ER）中合成并轉運至高爾基體（GA），隨后被分泌到肺泡表面發(fā)揮免疫防御和呼吸調控等作用［24］。PM2.5通過呼吸道到達肺泡表面并沉積，影響SP 的表達進而造成肺組織損傷， 引起呼吸系統(tǒng)疾病［25］。已有研究［8］證明高濃度PM2.5暴露下，顯著降低了A549 細胞和Balb/c 小鼠SP-A 蛋白的表達。眾所周知的是，SP-B 和SP-A 具有協(xié)同作用，執(zhí)行宿主防御活動并調節(jié)表面活性劑的生物物理性質，二者的功能合作在維持正常肺功能方面起到重要的保護作用［10，26］。有研究［27］表明，敲除SP-B 基因的小鼠和SP-B 基因突變的新生兒生后均死于呼吸窘迫。另外，LIN 等［28］發(fā)現(xiàn)用SP-B 啟動子驅動的CD59 特異性shRNA 包裝的JC 多瘤病毒樣顆粒能抑制人肺腺癌生長和轉移。本課題組前期通過Gepia Cancer 和Kaplan-Meier Plotter 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)SP-B 在肺癌組織中表達更低，且低表達SP-B 的肺癌患者生存期明顯縮短，提示SP-B 的表達可能作為肺癌的一種腫瘤標志物。值得注意的是，目前關于PM2.5對SP-B 表達的影響及意義尚未見報道，所以我們在PM2.5誘導MLE-12 細胞損傷的實驗基礎上，采用Western blotting 和qRT-PCR 檢測SP-B 的表達，結果顯示PM2.5濃度越高，SP-B 蛋白及mRNA表達下降越明顯，推測PM2.5致MLE-12 細胞損傷可能與SP-B 表達有關。

綜上所述，PM2.5可導致MLE-12 細胞發(fā)生損傷，可呈劑量依賴性損傷細胞形態(tài)和超微結構、抑制細胞活性，且下調SP-B 的表達。然而，單純檢測MLE-12 細胞的SP-B 蛋白和mRNA 變化尚不能闡明PM2.5的毒性機制問題，需進一步實驗比如觀察PM2.5對過表達或敲低SP-B 的MLE-12 細胞的損傷作用，以探討PM2.5的致毒機制，為PM2.5致肺損傷的治療策略提供一定科學依據(jù)。