PLCL2基因多態性觀察及其與大動脈粥樣硬化型腦梗死發病關系分析

王曉蓓，謝孟岐，劉梽潁，吳勤奮，張明洋，楊新玲

1 新疆醫科大學第二附屬醫院神經內科 新疆神經系統疾病研究重點實驗室，烏魯木齊 830063；2 新疆醫科大學

缺血性腦卒中是由于腦血管動脈粥樣硬化和腦血栓、腦栓塞等導致腦動脈狹窄或堵塞，引起腦血流減少，最終引發供血部位腦組織缺血、缺氧的急性腦功能障礙的疾病［1］。大動脈粥樣硬化（LAA）型腦梗死是缺血性腦卒中常見的發病類型，病情嚴重，預后較差，約有3/4 患者不同程度喪失勞動力或生活不能自理，給社會及家庭造成沉重的經濟負擔［2］。LAA 型腦梗死是多種因素共同作用的結果，動脈粥樣硬化是其主要病理過程，目前發病機制尚未完全明確［3］。磷脂酰肌醇特異的磷酸酯酶2（PLCL2）是一種蛋白質編碼基因，可以增強γ-氨基丁酸的受體結合活性，參與B 細胞激活、γ-氨基丁酸信號通路和B 細胞受體信號通路的負調控［4-5］。PLCL2可間接引起CRP、IL-6 分泌水平升高，促進炎癥反應并加速血管動脈粥樣硬化，在 LAA 型腦梗死的發生發展中可能起作用［6］。既往研究發現，PLCL2基因多態性與心肌梗死、缺血性腦卒中、代謝綜合征的發生有關系，但其與LAA 型腦梗死的關系仍未明確。本研究收集新疆地區LAA 型腦梗死患者及體檢健康人群的血液樣本分析PLCL2基因4個SNPs 位點（依據目的基因位點要有潛在功能，并且位于內含子、啟動子、5'UTR 區域的標簽位點，最后通過綜合考慮SNP 位點所在的功能區、功能預測結合已有研究文獻），即PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210 的基因多態性，并進一步探討PLCL2基因多態性與LAA型腦梗死的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021 年7 月—2022 年7 月就診于新疆醫科大學第二附屬醫院診斷為LAA 型腦梗死患者105 例（病例組），均符合腦梗死的診斷標準，均經臨床、頭部CT及頭部MRI掃描證實，且經頸動脈B超 + 頭顱磁共振血管造影、頭 + 頸部CT血管造影或腦數字剪影血管造影等證實腦血管的主干或分支>50%以上的狹窄或閉塞，推測源于動脈硬化，在供血區內發生急性腦梗死，直徑大于1.5 cm，TOAST 分型為 LAA 型；排除多臟器功能不全、風濕免疫性疾病、感染性疾病。病例組中男65 例、女40例，年齡 40~75（63.18 ± 12.97）歲；神經功能缺損評分（NIHSS評分） 4～40分，其中合并有吸煙史36例、飲酒史26 例、糖尿病史46例、高血壓史86例。對照組為本院同一時期年齡、性別、族別與病例組相匹配體檢健康人群103例， 排除腦血管病、風濕免疫性疾病以及近2 周內發生過炎性病變的人群，其中男52例、女51 例，年齡45~72（61.24 ± 11.04）歲，其中合并吸煙史23 例、飲酒史20 例、糖尿病史26 例、高血壓史66 例。本研究獲得新疆醫科大學第二附屬醫院倫理委員會批準，受試者均對多態性位點基因型檢測知情同意。

1.2 PLCL2 基因多態性分析 采集兩組入院外周靜脈血2.0 mL，以EDTA 抗凝，用磁珠法全血 DNA提取試劑盒 （中科拜爾）抽取DNA放置于–80 °C保存。基于飛行質譜的分型技術（massarray SNP）針對PLCL2 rs2014490、rs9824172 rs4685423、rs4618210 SNP 位點多態性進行分析，采用Agena 公司的Assay Designer4.0 軟件進行多重SNP 位點的引物設計評估，引物序列見表1，由北京博淼生物科技有限公司設計。

表1 PLCL2基因多態性位點引物和PCR序列

PCR 擴增反應步驟：取1.5 mL EP 管中配制PCR master mix，并振蕩低速離心；每個加樣孔中加入4 μL PCR master mix，最后加入1 μL 模板DNA（20 ng/μL）混勻，1 000 r/min 離心1 min。PCR 循環：94 ℃ 5 min（1 個循環），94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min（45 個循環），72 ℃ 3 min（1 個循環），4 ℃∝，在PCR 反應結束后，將PCR 產物用蝦堿性磷酸酶 （SAP）處理，以去除體系中游離的dNTPs。在新1.5 mL EP 管中配制堿性磷酸酶處理反應液，將SAP mix 加入384 孔PCR 反應板，反應總體積為7 μL，其中PCR 產物5 μL，SAP mix 2 μL。瞬時離心后進行如下反應程序：37 ℃、20 min， 85 ℃、5 min，4 ℃∝，并將384 孔反應板放置于PCR 儀上進行單堿基延伸反應。待檢測SNP基因型互補的單堿基延伸產物進行樹脂純化，樹脂純化后的延伸產物移至點樣儀上進行質譜檢測及數據輸出。將點樣后的SpectroCHIP 芯片使用MALDI-TOF 質譜儀分析，檢測結果使用TYPER4.0軟件獲取原始數據及基因分型圖，檢查數據文件的完整性和正確性，將結果保存并分析數據。

對病例組、對照組PLCL2 基因分布進行Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗，采用頻數計數法統計受檢人 群 PLCL2 rs2014490、rs9824172 rs4685423、rs4618210 位點上的基因型頻率；根據基因型頻率推算等位基因頻率，并將推算得到的等位基因頻率與對照組基因頻率的分布進行比較。

1.3 統計學方法 采用SPSS23.0 統計軟件。計數資料以例（%）表示，比較采用χ2檢驗，若超過1/4 單元格的理論頻數均<5，則采用Fisher's 精確概率法。基于遺傳模型（共顯性模型、顯性模型、隱性模型、超顯性模型），使用非條件 Logistics 回歸模型分析PLCL2 基 因 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210位點多態性與疾病的關聯，其關聯強度以比值比（OR）及95%置信區間（CI） 表示。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

Hardy-Weinberg 遺傳平衡檢驗結果顯示，PLCL2 rs2014490 位點GG、AG、AA 基因型在受檢人群中的實際頻數為52、97、56 例，計算得到3 種基因型 理 論 頻 數 為53.32、102.24、49.22 例，PLCL2 rs2014490 位點上各基因型的實際頻數和理論頻數的分布差異無統計學意義（χ2=0.599，P=0.741>0.05）。PLCL2 rs9824172 位點GG、GT、TT基因型在受檢人群中的實際頻數為53、94、61 例，計算得到3種基因型理論頻數為52、93.6、60.32 例，PLCL2 rs9824172 位點上各基因型的實際頻數和理論頻數的分布差異無統計學意義（χ2=0.008，P=0.996>0.05）。PLCL2 rs4685423位點AA、CA、CC基因型在研究對象中的實際頻數為54、89、62 例，計算得到3種 基因型 理論頻 數為47.97、102.34、55.43 例，PLCL2 rs4685423 位點上各基因型的實際頻數和理論頻數的分布差異無統計學意義（χ2=1.657，P=0.437>0.05）。PLCL2 rs4618210 位點AA、GA、GG基因型在研究對象中實際頻數為39、94、66例，計算得到3 種基因型理論頻數為36.80、97.55、64.66 例，PLCL2 rs4618210 位點上各基因型的實際頻數和理論頻數的分布差異無統計學意義（χ2=0.141，P=0.932>0.05） 。 說 明 PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210位點達到遺傳平衡，本研究中選取的樣本群體對LAA型腦梗死患者具有群體代表性。

2.1 兩組PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210 基因型頻率、等位基因頻率比較 PLCL2 rs2014490位點基因型為GG、AG、AA，在病例組中占比分別為29.1%、42.7%、28.2%，對照組中分別為21.5%、52%、26.5%；病例組等位基因G、A 基因頻率占比分別為50.5%、49.5%，對照組分別為47.5%、52.5%；兩組基因型頻率及等位基因頻率比較，χ2分 別 為2.13、0.35，P均>0.05。 PLCL2 rs9824172位點基因型為GG、GT、TT，在病例組中占比分別為26.7%、40%、33.3%，對照組中分別為24.3%、50.5%、25.2%；病例組中等位基因G、T頻率占比分別為46.7%、53.3%，對照組分別為49.5%、50.5%；兩組基因型頻率及等位基因頻率比較，χ2值分別為2.54、0.34，P均>0.05。PLCL2 rs4685423 位點基因型為AA、CA、CC，在病例組中占比分別為28.8%、35.6%、35.6%，對照組中分別為23.8%、51.5%、24.7%；病例組等位基因A、C 頻率占比分別為46.6%、53.4%，對照組分別為49.5%、50.5%；兩組基因型頻率及等位基因頻率比較，χ2分別為5.48、0.34，P均>0.05。PLCL2 rs4618210位點基因型為AA、GA、GG，在病例組中占比分別為16.7%、49%、34.3%，對照組分別為22.68%、45.36%、31.96%；病例組等位基因A、G 頻率占比分別為41.2%、58.8%，對照組分別為45.4%、54.6%；兩組基因型頻率及等位基因頻率比較，χ2值分別為1.14、0.70，P均>0.05。

2.2 PLCL2 基因的 4 個 SNPs 與LAA 型腦梗死的關系 PLCL2 基因rs2014490 位點，A 是野生型基因、G 是突變型基因，共顯性模型： GG vs.AA 和GT vs.AA；顯性模型：AG + GG vs.AA，隱性模型：AA +AG vs.GG；超顯性模型：AA + GG vs.AG。基于共顯性模型、顯性模型、隱性模型、超顯性模型的分析結果顯示，PLCL2 基因rs2014490 位點與LAA 型腦梗死發生風險無相關性（P均>0.05）。

PLCL2 基因rs9824172位點，T是野生型基因、G是突變型基因，共顯性模型：GG vs.TT 和GT vs.TT；顯性模型：GT + GG vs.TT；隱性模型：TT + TG vs.GG；超顯性模型：TT + GG vs.TG。基于共顯性模型、顯性模型、隱性模型、超顯性模型的分析結果顯示，PLCL2 基因rs9824172 位點與LAA 型腦梗死發生風險無相關性（P均>0.05）。

PLCL2 基因rs4685423位點，C是野生型基因、A是突變型基因，共顯性模型：AA vs.CC 和CA vs.CC；顯性模型：CA + AA vs.CC；隱性模型：CC + CA vs.AA；超顯性模型：CC + AA vs.AC。基于超顯性模型的分析結果顯示，PLCL2 基因rs4685423 位點與LAA 型腦梗死發生風險具有相關性（OR=0.52，95%CI0.30～0.91，P<0.05）；基于其他遺傳模型的分析結果顯示，rs4685423位點與LAA型腦梗死發生風險無相關性（P均>0.05）。

PLCL2 基因rs4618210位點，G是野生型基因、A是突變型基因，共顯性模型：AA vs.GG 和GA vs.GG；顯性模型：GA + AA vs.GG；隱性模型：GA +GG vs.AA；超顯性模型：GG + AA vs.GA。基于共顯性模型、顯性模型、隱性模型、超顯性模型的分析結果顯示，PLCL2 基因rs4618210 位點與LAA 型腦梗死發生風險無相關性（P均>0.05）。

3 討論

LAA 型腦梗死是多個基因與環境因素共同作用的復雜疾病，越來越多的研究表明，危險因素與基因多態性的交互作用對疾病的發生具有協同效應［7-10］。SNP分析已經被廣泛用于篩查腦梗死疾病易感基因位點。近年發現許多腦梗死的易感基因，如ZNF260 基因 rs34550124 多態性可能影響缺血性腦卒發生過程，并可能通過影響缺血性腦卒中患者的血壓、血糖及凝血功能而導致臨床癥狀不同［11］。LPL rs264 位點基因多態性可能與老年高血壓患者LAA型腦梗死的發病相關［12］。PLCL2基因是一種新的磷脂酶C樣蛋白，位于染色體3p24.3上，缺乏磷脂酶催化活性，是B細胞受體信號轉導和免疫應答的負調控因子［6，13］，可能在免疫系統中發揮重要作用，參與的疾病有急性心肌梗死、急性腦梗死、代謝綜合征、類風濕關節炎、新型冠狀病毒肺炎，并與中國人群COVID-19嚴重程度密切相關［14-15］。PLCL2缺陷小鼠的實驗數據表明，PLCL2是B細胞受體信號傳導和免疫應答的負調節劑，被證明間接調節成熟B細胞，從而通過FAS介導細胞凋亡，影響免疫炎癥應答。PLCL2基因可使免疫系統失調，促進血管動脈粥樣硬化，參與心肌梗死的慢性炎癥過程。

一項全基因組關聯研究［5］發現，PLCL2 是日本人心肌梗死的新易感基因。后來有伊朗的一項病例對照研究［4］發現，PLCL2，從而基因中的rs4618210 A>G 多態性有助于心肌梗死的病因學診斷。本研究發現，PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210基因型頻率、等位基因頻率在兩組間比較差異無統計學意義，PLCL2 基因多態性位點與疾病發生的結論不一致，考慮與LAA 型腦梗死的發生是個復雜的過程，是環境和基因相互作用的結果有關。HUANG 等［8］研究發現，PLCL2 基因rs4685423和rs4618210 SNP 可能與中國漢族人LAA 型腦梗死的危險性有關。SNP-SNP 相互作用分析顯示，rs4685423 是LAA 卒 中 風險影 響因素［8］。與 攜帶PLCL2 rs4685423 位點CC 基因型人群相比，攜帶AA基因型、CA 基因型的人群LAA 卒中發生風險降低。本研究結果發現，PLCL2 rs4685423 位點攜帶純合子（CC + AA 型）人群與攜帶雜合子（CA）人群相比患LAA 型腦梗死的可能性大。本研究與前人的研究中均發現PLCL2 rs4685423 位點CA 雜合子型患LAA 型腦梗死風險較其余基因型小，但是AA 純合子型研究結果不一致，考慮可能與不同人群遺傳因素和生活環境不同導致的遺傳表型發生變化有關。 HUANG 等［6，8］研 究 發 現，與 攜 帶PLCL2 rs 4618210 位點GG 基因型人群相比，攜帶AA 基因型、GA 基因型人群LAA 卒中的發病風險降低。本研究發現，基于共顯性模型、顯性模型、隱性模型、超顯性模型的分析結果顯示，PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4618210 位點與LAA 型腦梗死發病風險不存在統計學意義上的關聯，與文獻研究結果不一致，未來需進一步擴大樣本量再次驗證。

總之， LAA 型腦梗死及正常健康人群PLCL2 rs2014490、rs9824172、rs4685423、rs4618210 位點均以突變雜合子所占比例為最多。攜帶PLCL2 rs4685423 位點純合子（CC + AA 型）人群與攜帶雜合子（CA）人群相比患LAA 型腦梗死的可能性大。本研究也有一定的局限性，如研究對象均為新疆地區人群，由于遺傳影響與種族背景密切相關，可能不符合其他種族；研究樣本量小，對混雜因素調整不充分；采用了病例—對照研究設計，只能揭示相關因素與LAA 型缺血性腦卒中之間的潛在關聯，而無法確定因果關系。