不同濃度補陽還五湯含藥血清對缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖損傷的大鼠CTX-TNA2細胞系修復(fù)作用觀察

葉佳蓓，程建業(yè)，高雪亮，王凱，李普陽，王召，趙亞鵬*

1 河北省中醫(yī)院針灸科，石家莊 050011；2 河北中醫(yī)學(xué)院 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點實驗室；3 河北省中醫(yī)院外四科

缺血性卒中在我國的發(fā)病率和患病率呈逐年上升趨勢［1］，其中腦缺血再灌注（CI/R）損傷是影響缺血性卒中預(yù)后的重要病理生理過程，其導(dǎo)致的神經(jīng)損傷甚至有可能重于腦缺血造成的損傷［2］。對神經(jīng)細胞進行缺氧缺糖/復(fù)氧復(fù)糖（OGD/R）處理是體外模擬CI/R 損傷較為合理的方式［3-5］，以此來進行缺血性卒中離體層面的藥物及機制研究。出自《醫(yī)林改錯》的補陽還五湯是治療缺血性中風(fēng)病的經(jīng)典復(fù)方，主要包括黃芪、赤芍、當歸、紅花、桃仁、川芎、地龍，其可通過保護線粒體、調(diào)控神經(jīng)元自噬與凋亡、促進神經(jīng)修復(fù)及血管再生等機制發(fā)揮神經(jīng)保護作用［6-8］，我們也通過在體實驗證實這一點［9］。本研究中，我們將通過大鼠星形膠質(zhì)細胞系CTX-TNA2 建立OGD/R 模型模擬CI/R 損傷，探究離體情況下補陽還五湯對CI/R損傷星形膠質(zhì)細胞的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：CTX-TNA2 細胞即大鼠腦Ⅰ型星形膠質(zhì)細胞，購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司（iCell Bioscience Inc， Shanghai）。試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素—鏈霉素（10，000 U/mL）、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、胎牛血清、無糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液均購自GIBICO 公司，MTS 試劑盒購自Promega公司，LDH 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。儀器： 3111 型二氧化碳培養(yǎng)箱、3131 型三氣培養(yǎng)箱和Varioskan LUX 型多功能微孔板讀數(shù)儀購自Thermo Fisher Scientific 公司，SW-CJ-ID 型超凈工作臺購自蘇州凈化公司，Primovert 型倒置相差顯微鏡購自Carl Zeiss 公司，5702 型低溫離心機購自Eppendorf公司，0.22 μm濾膜購自Milipore公司。

1.2 補陽還五湯含藥血清和空白血清的制備 取30 只體質(zhì)量為230～240 g 的SD 雄性大鼠，由北京維通利華實驗動物科技有限公司提供，許可證號為SCXK（京）2016–0011，且動物實驗通過河北中醫(yī)學(xué)院倫理委員會審核批準（DWLL2020075），其中20只大鼠予補陽還五湯凍干粉水溶液灌胃，補陽還五湯凍干粉3.02 g /（kg· d）溶于2 mL/只的0.9%氯化鈉溶液中形成水溶液，另外10 只大鼠予2 mL/只的0.9%氯化鈉溶液灌胃，大鼠均連續(xù)灌胃7 d，最后1次灌胃后禁食水2 h，在無菌環(huán)境中進行腹主動脈取血并收集到促凝管中，全血常溫靜置15 min、4 ℃，2 500 r/min離心30 min，吸取上清，收集到一起離心混勻，56 ℃水浴30 min 滅活補體，經(jīng)0.22 μm 過濾除菌后存于-80 ℃冰箱。

1.3 CTX-TNA2 細胞分組、OGD/R 處理、補陽還五湯含藥血清加入 CTX-TNA2 細胞以完全培養(yǎng)基（含有10% 胎牛血清和1% 青鏈霉素混合液的DMEM 高糖培養(yǎng)基）、置于37 ℃ 74% N2+ 5% CO2+21% O2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每24～32小時當細胞匯合度達到70%～80%時進行1∶2或1∶3傳代。將復(fù)蘇后傳代3～4 次且處于對數(shù)生長期的CTXTNA2 細胞分為觀察組、血清組、模型組、正常組。其中正常組不做任何處理，常規(guī)培養(yǎng)；模型組棄去原培養(yǎng)基，用室溫預(yù)熱的PBS 潤洗細胞，吸盡PBS，加入不含糖、含鈣鎂的無糖培養(yǎng)基，并迅速置于37 ℃，含94% N2+ 5% CO2+ 1% O2的三氣培養(yǎng)箱中6 h 進行缺氧缺糖，然后把無糖培養(yǎng)基全部更換為完全培養(yǎng)基，重新置于37 ℃ 74% N2+ 5% CO2+ 21% O2環(huán)境中進行24 h 復(fù)氧復(fù)糖；觀察組和血清組細胞用上述方法進行6 h缺氧缺糖處理，然后分別用含0.5%、1%、3%、5%和10%補陽還五湯含藥血清（觀察1、2、3、4、5組）或0.5%、1%、3%、5%和10%空白血清（血清1、2、3、4、5 組）的完全培養(yǎng)基進行24 h 復(fù)氧復(fù)糖處理。

1.4 細胞存活率的檢測 采用MTS 法。將對數(shù)生長期的上述各組細胞接種于96 孔板中，每孔加入20 μL CellTiter 96水溶液試劑，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育50 min。在多功能微孔板讀數(shù)儀測定各孔490 nm 處的吸光度值。細胞存活率=（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）。

1.5 細胞乳酸脫氫酶漏出率的檢測 采用LDH法。將對數(shù)生長期的上述各組細胞接種于96 孔板中，吸取各細胞孔的上清液加入到另一新的96孔板中加入LDH 試劑，按說明書進行孵育，在多功能微孔板讀數(shù)儀中測450 nm 吸光度， 此為細胞上清中 LDH 釋放量；然后向原培養(yǎng)板中細胞加入1%Triton X-100，室溫反應(yīng)20 min 后取細胞反應(yīng)液及 LDH 工作液混勻，繼續(xù)在多功能微孔板讀數(shù)儀中測450 nm 吸光度，此為細胞破膜液 LDH 釋放量。LDH 漏出率（%）=上清 LDH 釋放量/（上清 LDH釋放量 + 細胞破膜液 LDH釋放量）×100%。

1.6 細胞形態(tài)和狀態(tài)的觀察 將對數(shù)生長期的上述各組細胞置于倒置相差顯微鏡下觀察其胞體狀態(tài)、突起形態(tài)及胞間連接情況，每組細胞采集3個視野的圖像留存。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以xˉ ± s 表示，滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗者，多樣本比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），兩兩比較采用Tukey 法；不滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗者，采用多個獨立樣本的非參數(shù)秩和檢驗（Kruskal-WallisHTest）。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞存活率比較 觀察1、2、3、4、5 組細胞 存 活 率 分 別 為92.90% ± 5.77%、94.00% ±12.43%、98.80% ± 6.55%、101.50% ± 0.61%、94.40% ± 19.75%，血清1、2、3、4、5組細胞存活率分別為88.85% ± 0.06%、92.64% ± 4.43%、90.15% ±2.44%、82.98% ± 16.48%、86.75% ± 12.41%，模型組細胞存活率為79.25% ± 2.15%，

正常組細胞存活率為141.20% ± 4.78%。與正常組相比，模型組細胞存活率減低（P<0.01）。觀察3、4 組細胞存活率升高（P均<0.01）。與血清4組相比，觀察4組細胞存活率更高（P<0.01）。

2.2 各組乳酸脫氫酶漏出率比較 觀察1、2、3、4、5 組細胞乳酸脫氫酶漏出率分別為26.06% ±3.31%、26.58% ± 2.94%、26.74% ± 2.67%、20.99% ± 2.48%、31.56% ± 2.42%，血清1、2、3、4、5 組細胞乳酸脫氫酶漏出率分別為25.31% ±3.48%、26.31% ± 2.26%、27.06% ± 1.26%、27.56% ± 1.62%、29.31% ± 2.97%，模型組乳酸脫氫酶漏出率為29.62% ± 0.91%，正常組乳酸脫氫酶漏出率為0。與正常組相比，模型組細胞乳酸脫氫酶漏出率增高（P<0.01）；與模型組相比，觀察組細胞乳酸脫氫酶漏出率降低（P<0.01）；與血清4 組比較，觀察4組乳酸脫氫酶漏出率低（P<0.05）。

2.3 各組細胞形態(tài)比較 由上述結(jié)果可知5%補陽還五湯含藥血清處理可對OGD/R 損傷后的細胞產(chǎn)生一定的修復(fù)作用，因此倒置相差顯微鏡重點觀察5%的補陽還五湯含藥血清及5%的空白血清對OGD/RCTX-TNA2細胞的影響。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常組細胞貼壁情況良好，細胞呈多角形、形態(tài)良好、胞膜光滑、胞體清晰，細胞排列較密集，細胞之間連接緊密；模型組細胞較正常組損傷嚴重，細胞胞體腫脹且狀態(tài)不佳、突起嚴重萎縮變形、胞質(zhì)分泌的顆粒樣物質(zhì)增多，細胞間連接斷裂嚴重甚至消失。經(jīng)過5%的補陽還五湯含藥血清和空白血清干預(yù)后，細胞胞體形態(tài)較模型組有所恢復(fù)，胞質(zhì)分泌顆粒減少，胞間突起均較模型組有所增加。其中，與5%空白血清相比，5%補陽還五湯含藥血清干預(yù)后細胞狀態(tài)的好轉(zhuǎn)情況更為明顯，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)更為清晰、顆粒明顯減少、突起萎縮及胞間連接顯著好轉(zhuǎn)，見圖1。

圖1 CTX-TNA2細胞形態(tài)（×200）

3 討論

目前，已有大量研究從在體實驗角度發(fā)現(xiàn)補陽還五湯能夠減輕CI/R 損傷［8，10-11］，其中星形膠質(zhì)細胞可通過降低其興奮性氨基酸毒性、減輕炎癥反應(yīng)和促進神經(jīng)修復(fù)等機制參與此過程。因此，本研究選擇從離體層面重點探討補陽還五湯對星形膠質(zhì)細胞的作用，研究對象選取大鼠星形膠質(zhì)細胞系即CTX-TNA2細胞。

中藥及復(fù)方的離體實驗研究主要有以下三種藥物干預(yù)方式：中藥提取物直接添加、含藥血清添加和含藥血漿添加。單味中藥的有效單體成分多直接添加到細胞培養(yǎng)體系中，而中藥復(fù)方若采取直接接觸細胞的方式，則會因為本身含有的雜質(zhì)及滲透壓、酸堿度、鞣質(zhì)成分、無機鹽離子等非特異性理化因素影響到最終實驗結(jié)果。本研究中使用的補陽還五湯通常是需要口服并經(jīng)吸收、代謝而起效，且鑒于含藥血清技術(shù)較為成熟、應(yīng)用廣泛，故采用補陽還五湯含藥血清作為離體實驗的干預(yù)方式。

血清藥理學(xué)是日本學(xué)者田代真一在20 世紀80年代提出的一研究中藥復(fù)方的體外實驗方法，經(jīng)過多年的發(fā)展，現(xiàn)已成為較為科學(xué)的、研究中藥藥效及作用機制和物質(zhì)基礎(chǔ)的方法。血清藥理學(xué)是指將單味中藥或中藥復(fù)方通過給動物灌胃一定時間后收集動物體內(nèi)血清即含藥血清，直接加入到離體反應(yīng)體系中進行藥效評價及機制研究。影響含藥血清藥效以及最終實驗結(jié)果的因素有很多，包括供體實驗動物選擇、含藥血清的給藥劑量和方案、采血時間、血清滅活與保存以及對照設(shè)計等方面。本研究采用與CTX-TNA2 細胞同種屬的SD 大鼠作為供體實驗動物來制備含藥血清，以此來縮小動物血清和動物細胞之間的差異。在給藥劑量方面，為保證動物連續(xù)灌胃給藥的一致性，課題組前期將補陽還五湯水煎液統(tǒng)一制成凍干粉，經(jīng)臨床用藥量、動物等效劑量系數(shù)（按體表面積）和凍干粉得粉率換算后確定3.02 g/（kg·d）為SD 大鼠給藥劑量、2 mL 為大鼠灌胃體積。同時有研究［12］表明補陽還五湯的含藥血清無明顯的量效依存關(guān)系，應(yīng)以臨床等效劑量為基準。在給藥方案和采血方案上，根據(jù)大量文獻和本課題組前期研究，我們對大鼠進行連續(xù)7 d灌胃和最后一次灌胃后空腹2 h采血，以此達到含藥血清中血藥濃度的穩(wěn)定。在血清滅活方面，為減少血清中多種酶、抗體、補體等生物活性物質(zhì)對實驗結(jié)果的影響，本研究選擇同時滅活處理含藥血清和空白血清，滅活并不影響細胞生長，這樣更加突出含藥血清中補陽還五湯的作用。在對照設(shè)計方面，本研究全程選擇經(jīng)相同灌胃和采血處理后得到的空白血清作為對照，使含藥血清組的結(jié)果更具可比性。另外，對于離體反應(yīng)體系中含藥血清的添加方式，我們將含藥血清視為一種外來添加物，選擇含藥血清和常規(guī)細胞培養(yǎng)血清并存的方法，即在復(fù)氧復(fù)糖10%胎牛血清基礎(chǔ)上額外添加不同體積分數(shù)的含藥血清，雖然增加了細胞復(fù)氧復(fù)糖時的總血清含量，但是這種方式穩(wěn)定了細胞狀態(tài)，保證了所有細胞反應(yīng)體系的一致性，還能更好地模擬在體實驗中的干預(yù)方式。

細胞存活率反映外源添加物質(zhì)對細胞活力和健康程度的影響，乳酸脫氫酶漏出率反映外源添加物質(zhì)對細胞產(chǎn)生的毒性作用，以此來發(fā)現(xiàn)補陽還五湯含藥血清抗CTX-TNA2 細胞OGD/R 損傷的最佳參考濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在完全培養(yǎng)基中加入5%補陽還五湯含藥血清可顯著提高OGD/R 損傷的CTXTNA2 細胞存活率并降低其乳酸脫氫酶漏出率，而且優(yōu)于同濃度的空白血清。然后通過倒置相差顯微鏡觀察正常組、模型組、觀察組和血清組的細胞胞體及突起情況時，發(fā)現(xiàn)5%補陽還五湯含藥血清處理的細胞在OGD/R 損傷后恢復(fù)較好。因此，5%可作補陽還五湯含藥血清減輕CTX-TNA2 細胞OGD/R損傷的參考濃度。

綜上所述，本研究通過離體實驗探究了補陽還五湯對大鼠CTX-TNA2細胞的保護作用，發(fā)現(xiàn)5%補陽還五湯含藥血清可修復(fù)CTX-TNA2 細胞OGD/R損傷。在此基礎(chǔ)上我們將對補陽還五湯離體層面的神經(jīng)保護機制進行深入研究，并在中藥復(fù)方血清藥理學(xué)應(yīng)用上進行探索。