羅哌卡因對人結腸癌順鉑耐藥細胞株順鉑敏感性的增強作用及其機制

趙文博，曾煉，胡鵬超，程欣冉，羅輝宇

1 湖北醫藥學院附屬襄陽市第一人民醫院麻醉科，湖北襄陽 441000；2 湖北醫藥學院基礎醫學院

結直腸癌（CRC）在我國癌癥相關死因中躍居第四位［1］。順鉑是臨床上CRC 的一線治療藥物，但隨著腫瘤細胞對化療藥物耐藥現象的發生，導致CRC患者復發和死亡率居高不下。據統計，Ⅰ期結直腸癌的5 年相對生存率為90%，而發生化療耐藥導致遠處轉移的Ⅳ期CRC 5 年相對生存率僅為14%［2］。腫瘤耐藥的機制至今尚不完全清楚，在諸多耐藥機制中細胞內活性氧（ROS）水平被認為與腫瘤細胞的耐藥性密切相關。一般情況下癌細胞常表達高水平抗氧化蛋白以清除過量的ROS，避免細胞發生氧化性死亡，進而耐藥性增強［3］。因此促進ROS 堆積誘導細胞氧化應激失衡可能成為逆轉癌癥耐藥的新方向。鐵死亡為近年新發現的一種細胞死亡形式，是一種鐵依賴形式的非凋亡性細胞死亡，由胱氨酸耗盡和大量脂質過氧化控制的膜損傷引起。鐵死亡發生后細胞內升高的ROS 水平和線粒體膜電位下降共同導致了腫瘤細胞氧化應激的失衡和抗氧化能力的減弱。由于許多化療藥物如順鉑，主要通過損傷腫瘤細胞DNA 來發揮治療作用，而耐藥腫瘤細胞中抗氧化蛋白表達升高阻礙了順鉑誘導的DNA 損傷，并加速已損傷DNA 修復，最終使腫瘤免于損傷甚至死亡。因此通過誘導細胞發生鐵死亡可能成為治療腫瘤耐藥的一種潛在治療方法。核紅細胞2相關因子2（Nrf-2）是一類驅動各種抗氧化劑相關基因表達的蛋白質，主要參與體內的抗氧化作用。谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）是鐵死亡的核心調控蛋白，可清除ROS 等過氧化物來避免細胞受到氧化應激性損傷，當Nrf-2/GPX4 蛋白表達受到抑制時能夠誘導鐵死亡的發生［4］。溶質載體家族7 成員11（SLC7A11）是鐵死亡的抑制因子。Nrf-2、GPX4、SLC7A11 均為鐵死亡相關蛋白，在鐵死亡的誘導中發揮重要作用。近年，局麻藥羅哌卡因可減少全麻用藥并緩解外科手術產生的急性疼痛，因而常被用于癌癥患者圍術期治療。臨床研究［5］表明，羅哌卡因對癌癥患者的預后有改善作用。然而，羅哌卡因能否增強CRC 順鉑耐藥細胞株對順鉑的敏感性尚不清楚。2020 年3 月—2023 年6 月，我們觀察了羅哌卡因對人結腸癌細胞株順鉑敏感性的增強作用，并探討了其作用機制是否與由Nrf-2、GPX4、SLC7A11 及線粒體膜電位水平降低、ROS 水平升高誘導的鐵死亡有關。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑、儀器 人結腸癌LOVO 細胞株購自武漢普諾賽生命科技有限公司。鹽酸羅哌卡因購自宜昌人福藥業股份有限公司；順鉑購自江蘇豪森藥業集團有限公司；胎牛血清購自美國Gibco 公司；RPMI-1640細胞培養液購自美國Gibco公司；胰酶細胞消化液、SDS-PAGE凝膠試劑盒、RIPA細胞裂解液購自中國沈陽萬類生物公司；CCK-8 試劑盒、AnnexinV-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒、細胞核染料Hoechst 33258、HRP 標記的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG 購自中國上海碧云天生物科技有限公司；線粒體膜電位檢測試劑盒JC-1 和H2DCFDA 綠色熒光探針購自江蘇凱基生物技術有限公司；DyLight 488 綠色熒光Ⅱ抗、GAPDH 抗體購自Abcam 公司；MMP-9 抗體購自中國武漢三鷹生物技術有限公司；GPX4 抗體、Nrf-2抗體和SLC7A11 抗體購自美國Cell Signaling Technology 公司；Fe2+檢測試劑盒購自日本Dojind 公司。二氧化碳培養箱（美國Thermo）、生物安全柜（中國力康）、IX70 倒置熒光顯微鏡（日本Olympus）、多功能熒光酶標儀（美國Molecular Devices）。流式細胞儀（美國BD）、蛋白質免疫印跡電泳槽和轉膜槽（美國Bio-rad）、高速冷凍離心機（德國Eppendorf）。

1.2 結腸癌順鉑耐藥LOVO/DDP 細胞株的構建及順鉑、羅哌卡因干預濃度的篩選 采用1 μg /mL 的順鉑與進入對數生長期的LOVO 細胞共同培養24 h 后，更換不含順鉑的培養液，待細胞穩定生長后傳代，重復上述步驟 5 次后，將順鉑濃度更換為2 μg /mL，繼續 重復上 述 操作 5 次，再更 換為5 μg/mL 的順鉑處理細胞 3 次。直至LOVO 細胞株在 5 μg /mL 濃度下穩定生長和傳代，將其命名為LOVO/DDP細胞株。

將LOVO 及LOVO/DDP 細 胞 分 別 以1×105個/mL 接種于6 孔板中并加入2 mL /孔RPMI-1640培養液，待細胞貼壁后，置于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態并拍照。光鏡下LOVO 細胞呈長梭形，有突起，散在生長；而LOVO/DDP 細胞呈近圓型，少突起，成團生長。采用CCK-8 法檢測不同濃度（0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μmol/L）順鉑處理以上兩種細胞48 h 后，LOVO 細胞中存活率分別為100.00% ± 2.09%、100.66% ± 2.47%、93.15% ±2.21%、37.51% ± 3.33%、13.05% ± 1.47%，LOVO/DDP 細 胞 存 活 率 分 別 為99.50% ± 1.21%、98.79% ± 1.47%、96.62% ± 1.19%、（94.61% ±0.89%）%、（60.51% ± 3.13%）%、（25.47% ± 1.88%。結果表明低濃度順鉑處理結腸癌細胞株48 h后，LOVO 細 胞 株 的 存 活 率 降 低（P<0.01），而LOVO/DDP 細胞株的存活率無明顯變化（P>0.05）。隨順鉑濃度升高，LOVO 細胞活力明顯下降，IC50 為0.927 μmmol/L；在低濃度順鉑作用下，LOVO/DDP 細胞活力下降不明顯，在高濃度順鉑處理后細胞活力才下降，IC50為2.493 μmmol/L。上述結果表明，與LOVO/DDP細胞株相比，LOVO 細胞株對順鉑更敏感。結腸癌順鉑耐藥細胞株構建成功。選擇兩種結腸癌細胞株存活率差異最為顯著的順鉑干預濃度1.0 μmol/L 作為后續實驗所用順鉑的濃度。

將LOVO 及LOVO/DDP 細 胞 分 別 以1×105個/mL 接種于6 孔板中并加入2 mL /孔RPMI-1640培養液，待細胞貼壁后加入0、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mmol/L 羅哌卡因處理以上兩種細胞48 h 后，采用CCK-8 法檢測不同濃度羅哌卡因作用后LOVO及LOVO/DDP 細胞株存活率。結果LOVO 細胞株中存活率分別為100.00% ± 1.25%、98.57% ± 2.08%、97.47% ± 1.59%、92.24% ± 3.69%、63.41% ±3.44%、33.18% ± 0.92%，LOVO/DDP細胞存活率分別為100.00% ± 2.36%、99.75% ± 6.83%、95.46% ±4.14%、90.27% ± 4.60%、76.93% ± 1.66%、45.70% ±5.68%。結果顯示低濃度的羅哌卡因處理 LOVO 細胞和 LOVO/DDP 細胞株，細胞株活力無明顯變化（P>0.05），僅羅哌卡因濃度大于 1.0 mmol/L 時，兩種結腸癌細胞株活力發生下降，呈劑量依賴性。CCK-8 實驗結果表明低濃度羅哌卡因對 LOVO 細胞和 LOVO/DDP 細胞存活率無明顯影響。與單獨順鉑1.0 μmmol/L 作用相比，1 mmol/L 羅哌卡因聯合1.0 μmmol/L 順鉑作用后 LOVO/DDP 細胞存活率由94.61% ± 0.89%下降為62.95% ± 5.85%，差異有統計學意義（P<0.01）。由于1 mmol/L 以上濃度的羅哌卡因對細胞毒性較強易掩蓋羅哌卡因的增敏作用，因此我們選擇 1 mmol/L的羅哌卡因用于后續實驗。

1.3 LOVO 和 LOVO/DDP 細胞株分組及羅哌卡因干預 將LOVO 和LOVO/DDP 兩種細胞分別設立4個組別，分別為羅哌卡因組 + 順鉑組、羅哌卡因組、順鉑組、對照組。對照組加入細胞培養液培養；羅哌卡因組加入細胞培養液和1 mmol/L 濃度羅哌卡因培養；順鉑組加入細胞培養液和1.0 μmol/L 濃度順鉑培養；羅哌卡因聯合順鉑組加入細胞培養液后再同時加入1.0 μmol/L 濃度順鉑及1 mmol/L 濃度羅哌卡因培養。

1.4 各組增殖、遷移能力的觀察 采用平板克隆實驗觀察細胞株增殖能力。取上述各組細胞株，均勻接種于6 孔板中，置于37 ℃、5% CO2的細胞孵育箱中。培養14 d 后，用4%多聚甲醛固定15 min，洗滌2 次，用0.1%結晶紫染色15 min 后洗滌多余染料，觀察細胞株克隆形成數并拍照。

采用Transwell實驗觀察細胞株遷移情況：取上述各組細胞株，接種于含無血清培養基的Transwell的上室中，并在下室中加入600 μL含 10% FBS的培養基，上下層培養液以聚碳酸酯膜相隔，下層培養液中的成分可以影響到上室內的細胞，培養48 h 后，用 4%多聚甲醛固定細胞，再用 0.1% 結晶紫染色30 min，用PBS洗 3 遍。在顯微鏡下觀察細胞遷移情況。

采用Western blotting 法檢測細胞遷移蛋白MMP-9。取上述各組細胞，通過裂解液破碎離心加熱提取蛋白質樣品，然后上樣。 電泳、轉膜、封閉、孵育一抗（MMP-9，1∶2 000） 4 ℃ 過夜。次日洗膜3次后，加HRP 標記的二抗（山羊抗兔IgG，1∶2 000）室溫孵育120 min，加入超特敏ECL 進行顯色，采用Image J軟件測定條帶灰度值進行分析。

1.5 各組細胞凋亡情況觀察 采用流式細胞術。取上述各組細胞，按常規操作步驟上流式細胞儀檢測。凋亡率（%）=凋亡細胞/細胞總數 ×100%。

1.6 各組細胞線粒體膜電位的觀察、ROS及亞鐵離子的檢測 采用JC-1線粒體膜電位染色法。取上述各組細胞，吸走培養液，PBS洗滌細胞。加入線粒體膜電位試劑盒中JC-1 工作液，置于培養箱孵育30 min后，用PBS再次清洗細胞2遍，用4%多聚甲醛固定細胞。再用Hoechst 33258 標定細胞核，置于熒光顯微鏡下拍照，觀察熒光強度，并計算JC-1多聚體紅色熒光與單體綠色熒光的比值 ［JC-1（Red/Green）］。

采用熒光染色法測定ROS。取上述各組細胞在培養箱37 ℃條件下孵育 30 min，用PBS 洗滌細胞2遍，再用4%多聚甲醛固定15 min 后加入H2DCFDA綠色熒光探針10 min，隨后使用無血清培養液洗滌細胞2遍，再次使用Hoechst 33258標記細胞核，避光染色5 min。置于熒光顯微鏡下拍照，觀察熒光強度，并計算相對熒光強度。采用免疫熒光法檢測亞鐵離子，最后置于熒光顯微鏡下觀察和拍照。

1.7 各組鐵死亡相關蛋白Nrf-2、GPX4、SLC7A11的檢測 取上述各組細胞，按Western blotting 試劑盒操作步驟操作檢測Nrf-2、、GPX4、SLC7A11 蛋白，結果以灰度值表示。

1.8 統計學方法 采用GraphPad Prism 8進行制圖和統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。 以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組增殖、遷移能力及凋亡情況 LOVO 細胞中，與對照組比較，順鉑組LOVO 細胞株形成的克隆體數明顯減少，羅哌卡因組克隆體形成數無差異，順鉑聯合羅哌卡因組細胞株克隆體數減少；與順鉑組比較，順鉑聯合羅哌卡因組細胞株克隆體數進一步下降。在LOVO/DDP 細胞株中，與對照組比較，順鉑組、羅哌卡因組細胞株克隆體數目下降不明顯，順鉑聯合羅哌卡因組細胞株克隆體形成數減少；與順鉑組比較，順鉑聯合羅哌卡因組細胞株克隆體數明顯減少（圖1）。

圖1 羅哌卡因、順鉑單獨及聯合干預后LOVO及LOVO/DDP細胞株克隆體

LOVO細胞株和LOVO/DDP細胞株中，與對照組相比，順鉑組和羅哌卡因組遷移細胞株數目均減少，羅哌卡因聯合順鉑組遷移細胞株數減少；與順鉑組比較，羅哌卡因聯合順鉑組遷移細胞株數減少（見圖2）。

圖2 羅哌卡因、順鉑及聯合用藥后遷移的LOVO與LOVO/DDP細胞株

LOVO 細胞株中，羅哌卡因組 + 順鉑組、羅哌卡因組、順鉑組、對照組MMP-9 蛋白水平分別為0.55 ± 0.13、1.08 ± 0.09、0.75 ± 0.08、1.34 ±0.07，與對照組比較，順鉑組MMP-9 蛋白水平降低（t=5.67，P<0.05），羅哌卡因組差異無統計學意義；與順鉑組比較，羅哌卡因組 + 順鉑組MMP-9 蛋白差異無統計學意義（P>0.05）。LOVO/DDP 細胞株中，羅哌卡因組 + 順鉑組、羅哌卡因組、順鉑組、對照組MMP-9 蛋白水平分別為0.34 ± 0.04、0.88 ± 0.01、0.60 ± 0.01、1.30 ± 0.05，與對照組比較，順鉑組、羅哌卡因組MMP-9 蛋白水平差異無統計學意義；與順鉑組比較，羅哌卡因組 + 順鉑組MMP-9 蛋白水平降低（t=4.43，P<0.05）。

LOVO 細胞株中，與對照組細胞株比較，順鉑組凋亡細胞率升高、存活率下降，羅哌卡因組細胞凋亡率、存活率差異無統計學意義，羅哌卡因聯合順鉑組細胞凋亡率升高、存活率下降（t=18.49，P<0.01）；與順鉑組比較，羅哌卡因聯合順鉑組細胞凋亡率升高、存活率下降（t=10.95，P<0.01）。LOVO/DDP 細胞株中，與對照組相比，順鉑組、羅哌卡因組細胞凋亡率差異無統計學意義；與順鉑組、羅哌卡因組比較，順鉑聯合羅哌卡因組細胞凋亡率升高（t=18.29，P<0.01），見表1。

表1 LOVO和LOVO/DDP中各組細胞存活率、細胞凋亡率（%， ± s）。

表1 LOVO和LOVO/DDP中各組細胞存活率、細胞凋亡率（%， ± s）。

組別LOVO細胞株細胞存活率細胞凋亡率羅哌卡因 + 順鉑組羅哌卡因組順鉑組53.42 ± 2.86 12.46 ± 3.63 29.69 ± 1.92對照組LOVO/DDP細胞株40.97 ± 4.05 89.03 ± 0.32 68.63 ± 2.56 93.67 ± 0.78 5.81 ± 0.82羅哌卡因 + 順鉑組26.07 ± 1.30羅哌卡因組順鉑組7.58 ± 0.69 12.81 ± 0.73對照組71.34 ± 1.03 91.21 ± 0.42 85.68 ± 0.57 93.16 ± 1.35 6.28 ± 1.38

2.2 LOVO 細胞株及LOVO/DDP 細胞株中各組線粒體膜電位、ROS 及亞鐵離子水平比較 在LOVO細胞株和LOVO/DDP 細胞株中，與對照組比較，羅哌卡因組、順鉑組及羅哌卡因聯合順鉑組JC-1 多聚體紅色熒光與單體綠色熒光的比值［JC-1（Red/Green）］均降低，并且以羅哌卡因聯合順鉑組下降最為顯著（t分別為64.77、9.98，P均<0.01），見表2。

表2 LOVO細胞株及LOVO/DDP細胞株中各組線粒體膜電位、ROS及亞鐵離子水平

在LOVO 細胞株和LOVO/DDP 細胞株中，與對照組比較，羅哌卡因組、順鉑組及羅哌卡因聯合順鉑組ROS 水平升高，以羅哌卡因聯合順鉑組為著（t分別為37.13、59.53，P<0.01），見表2。

亞鐵離子染色結果顯示，在LOVO細胞株和LOVO/DDP細胞株中，與對照組相比，羅哌卡因組、順鉑組、羅哌卡因聯合順鉑組Fe2+熒光強度均增強，且以羅哌卡因聯合順鉑組增強最為顯著（P<0.01），見表2。

2.3 LOVO 細胞株及LOVO/DDP 細胞株中鐵死亡相關蛋白Nrf-2、GPX4、SLC7A11水平比較 在LOVO細胞株中，與對照組相比，羅哌卡因組、順鉑組、羅哌卡因聯合順鉑組Nrf-2、GPX4、SLC7A11 蛋白水平均下降（tNrf-2分別為4.63、11.84、26.82，tGPX4分別為4.11、12.28、14.78，tSLC7A11分 別 為7.24、8.70、14.78， P均<0.01）；與順鉑組相比，羅哌卡因聯合順鉑組Nrf-2、GPX4、SLC7A11 蛋白水平降低（t分別為8.54、3.17、6.14，P均<0.01）。在LOVO/DDP細胞株中，與對照組相比，順鉑組GPX4 蛋白下降（t=8.58，P<0.01）、羅哌卡因組GPX4 蛋白下降（t=3.28，P<0.05），順鉑組及羅哌卡因組Nrf-2、SLC7A11 蛋白表達水平下降（tNrf-2分別為12.08、8.49，tLSLC7A11分別為5.57、4.49，P均<0.01），羅哌卡因聯合順鉑組Nrf-2、GPX4、SLC7A11 蛋白水平均下降（t分別為25.33、11.37、11.26，P<0.01）；與順鉑組相比，羅哌卡因聯合順鉑組細胞株中Nrf-2、GPX4、SLC7A11 蛋 白 水 平 下 降（t分 別 為9.73、7.56、7.17，P均<0.01），見表3、圖3。

表3 LOVO和LOVO/DDP細胞株中各組GPX4、Nrf-2、SLC7A11蛋白水平（ ± s）

表3 LOVO和LOVO/DDP細胞株中各組GPX4、Nrf-2、SLC7A11蛋白水平（ ± s）

組別LOVO細胞株Nrf-2蛋白GPX4蛋白SLC7A11蛋白羅哌卡因 + 順鉑組羅哌卡因組順鉑組對照組LOVO/DDP細胞株0.17 ± 0.03 0.75 ± 0.06 0.49 ± 0.05 0.97 ± 0.03 0.33 ± 0.04 0.76 ± 0.02 0.51 ± 0.02 0.89 ± 0.04 0.71 ± 0.03 1.04 ± 0.04 0.87 ± 0.06 1.40 ± 0.06羅哌卡因 + 順鉑組羅哌卡因組順鉑組對照組0.51 ± 0.04 1.14 ± 0.03 0.93 ± 0.05 1.44 ± 0.04 0.34 ± 0.07 1.07 ± 0.08 0.70 ± 0.02 1.39 ± 0.11 0.63 ± 0.06 1.10 ± 0.01 1.01 ± 0.04 1.28 ± 0.06

圖3 LOVO和LOVO/DDP細胞株Nrf-2、SLC7A11及GPX4表達的Western blotting電泳圖

3 討論

CRC 是常見的胃腸道惡性腫瘤，此病好發于40歲以上中老年人，男性多于女性。CRC 早期常無明顯臨床表現或僅有排便習慣和糞便性狀的改變，因此難以及時發現。當患者出現全身明顯癥狀時常已到晚期，預后很差［6］。盡管目前治療方案多樣，但順鉑仍是CRC 患者重要的治療藥物，順鉑在治療初期能夠有效抑制腫瘤細胞增殖和轉移并促進細胞凋亡，但是隨著其廣泛使用，CRC 逐漸產生對順鉑的耐藥性［7］。因此解決CRC的順鉑耐藥性成為亟待解決的科研問題。

近年，越來越多研究證實，局麻藥可直接或間接影響腫瘤的進展。體外和體內實驗發現，局麻藥可抑制腫瘤復發，目前認為這種效應是多種因素共同調節的結果［8-9］。研究表明，局麻藥羅哌卡因可以通過調節Ras 和RhoA 信號通路、整合素ITGα2 和ITGβ1、Wnt/β-連環蛋白、血管內皮生長因子（VEGF）、細胞凋亡相關途徑和細胞周期停滯、細胞外信號調節激酶ERK、非編碼RNA、Na+通道、脫氧核糖核酸去甲基化、NF-κB 途徑、MMP-9、PI3K/AKT 途徑及JNK 途徑發揮抗腫瘤作用，并且大多數與腫瘤的化療敏感性有關［10］。雖然羅哌卡因在腫瘤治療中直接增敏作用的相關研究十分缺乏，但是已有研究表明同樣屬于酰胺類麻醉藥的利多卡因和布比卡因這兩種可局麻藥能夠通過抑制細胞內RASSF1A 甲基化水平，使RASSF1A 表達增加，進而增強順鉑對肝癌HepG2 和BEL-7402細胞的毒性作用［11］。根據以上研究，我們推測羅哌卡因具有增強腫瘤化療敏感性的潛能。研究［12］報道，羅哌卡因可以促進細胞內ROS 的生成增多，從而促進細胞鐵死亡發生。因此羅哌卡因與細胞鐵死亡的發生是否存在聯系以及在腫瘤治療中是否具有藥效關系值得研究。

本研究通過體外建立的人結腸癌順鉑耐藥LOVO/DDP 細胞株不僅形態上與LOVO 細胞株存在明顯差異，而且顯著減弱了順鉑的細胞毒作用，說明發生順鉑耐藥的 LOVO/DDP 細胞株與順鉑敏感的LOVO 細胞株相比，改變顯著且耐藥特性突出。本研究中CCK-8 實驗發現，羅哌卡因單獨處理時1 mmol/L 及以下濃度時對兩種結腸癌細胞株均無明顯細胞毒作用，僅當濃度超過1 mmol/L 時可直接損失腫瘤細胞，說明低濃度羅哌卡因對結腸癌細胞株無直接治療效果；而與之前單獨順鉑處理相比，1 mmol/L 羅哌卡因聯合1 μmol/L 順鉑處理兩種結腸癌細胞株后，LOVO 細胞株存活率進一步下降；LOVO/DDP 細胞株在1 μmol/L 順鉑處理后存活率無明顯改變，1 mmol/L 羅哌卡因聯合1 μmol/L 順鉑處理后，細胞存活率發生明顯下降。通過以上結果并結合文獻報道中羅哌卡因在腫瘤治療中的作用，我們認為低濃度羅哌卡因雖無直接的細胞毒性作用，但其可能具有潛在的對化療藥物的增敏作用。通過平板克隆實驗、Transwell 實驗、MMP-9 表達檢測和流式細胞術的實驗結果，我們發現順鉑聯合羅哌卡因增強了對結腸癌細胞株尤其是LOVO/DDP 細胞株增殖和遷移的抑制及促凋亡作用。這說明羅哌卡因或許能成為一種腫瘤治療中的輔助藥物或增敏劑。羅哌卡因對順鉑具有增敏作用，但其作用機制仍尚不清楚。

鐵死亡是近年新發現的細胞死亡方式。已有研究［13-14］證實，鐵死亡的發生能夠增強已耐藥腫瘤細胞對順鉑、多柔比星及紫杉醇等多種抗癌藥物的敏感性。目前認為，鐵死亡能夠增強其他常規抗癌治療的敏感性是由于其通過調控GPX4、SLC7A11、Nrf-2 等蛋白表達水平加速了細胞內谷胱甘肽的耗竭和ROS 的堆積，從而導致細胞處于氧化應激性失衡的敏感狀態，進而在遇到其他化療藥物后更易于死亡。然而，到目前為止鐵死亡在癌癥化療敏感性方面的研究仍有限，需要更多研究加以補充。

有研究［15］發現，羅哌卡因可以誘導線粒體裂變蛋白DRP1，產生ROS 并引起線粒體功能障礙，包括線粒體膜電位降低、細胞色素C 氧化酶活性增強和ATP 產生。因此羅哌卡因是否也通過此機制即線粒體的改變及ROS 的產生增多，在腫瘤治療中發揮了增敏作用需要進一步驗證。本研究結果發現與文獻報道結果類似，羅哌卡因處理后兩種結腸癌細胞株內線粒體膜電位均發生了下降且細胞內ROS 水平及亞鐵離子明顯增多，羅哌卡因聯合順鉑組最為明顯。而線粒體形態和功能的改變、ROS 的積累及亞鐵離子增多已被證實是鐵死亡發生的標志，降低的線粒體膜電位和細胞內增多的ROS，為人結腸癌細胞株鐵死亡發生創造了有利條件。

Nrf-2 是一種轉錄因子，與kelch 樣ECH 關聯蛋白1（Keap1）和抗氧化反應元件（Are）一起，調節抗氧化蛋白的表達，保護細胞免受由ROS 引起的應激性損傷［16］。當細胞內ROS 水平升高， Keap1-Nrf-2 復合體分解而抑制Nrf-2 泛素化，然后Nrf-2 轉位到細胞核并與Are 結合，誘導抗氧化蛋白的表達。在CRC 的耐藥機制中，GPX4 的過度表達會導致化療藥物效果下降，最終誘導癌細胞耐藥的發生。此外，細胞內高表達的GPX4 還可通過調節ROS 水平來影響腫瘤上皮—間充質轉化，與患者預后不佳密切相關［17］。GPX4 表達或功能的下降可增強化療藥物對氧化應激誘導的細胞死亡的易感性［18-20］。已有研究證實，抑制Nrf-2 的表達能夠增強CRC 細胞和肝癌細胞等對順鉑、阿霉素、索拉非尼的敏感性［21-23］。SLC7A11不僅是鐵死亡的有效靶標，在多種腫瘤耐藥的治療中，SLC7A11 也扮演重要的角色，包括肺腺癌、胃癌、結直腸癌、膠質瘤等等。我們對鐵死亡核心調控蛋白表達水平進行了測定，結果發現羅哌卡因聯合順鉑顯著抑制了Nrf-2、GPX4 及SLC7A11 的表達。以上結果提示羅哌卡因與順鉑聯合用藥可能是通過調控Nrf-2、GPX4 及SLC7A11 蛋白，降低線粒體膜電位及促進ROS 積累，誘導細胞發生鐵死亡，從而增強人結腸癌順鉑耐藥細胞株的順鉑敏感性。

總之，羅哌卡因可增強人結腸癌順鉑耐藥細胞株順鉑敏感性，其作用機制可能與由 Nrf-2、GPX4、SLC7A11 及線粒體膜電位水平降低、ROS水平升高誘導的鐵死亡有關。然而，目前我們的研究局限于體外實驗，對羅哌卡因誘導鐵死亡在腫瘤耐藥過程中的作用機制了解仍十分有限，還需進一步的體內實驗和臨床觀察進行多方面驗證。