mNGS 在發熱血液腫瘤患者血液病原體檢測中的應用及細菌檢出陽性預測模型構建

陳姝諭，雷坳錡，顏學兵

徐州醫科大學附屬醫院感染性疾病與肝病科，江蘇徐州 221000

宏基因組二代測序技術（mNGS）作為一種新興的分子診斷技術，于2014 年首次用于感染性疾病的診斷，此后逐漸用于新發或罕見病原體的檢測、感染性疾病的監測和預防、病原體耐藥基因突變，并逐漸在不同人群、部位及樣本類型的感染中展開探索。血液腫瘤患者是血流感染的高危人群，病死率高［1］。血液腫瘤患者最常見的臨床癥狀是發熱，其發熱原因主要有二種，一是感染性疾病導致的發熱，需早期診斷并準確選擇抗菌藥物；二是腫瘤本身導致的發熱，需盡早抗腫瘤治療。抗腫瘤治療后伴隨一定程度的免疫抑制，若此時合并感染，癥狀不典型且來勢兇猛。這就要求臨床醫師抗腫瘤治療前盡量識別并控制感染。血液腫瘤患者發熱原因往往難以第一時間鑒別［2］。感染指標特異性不高［3］，傳統病原體檢測各有局限性。mNGS 不依賴培養，無偏好性，直接從樣品中提取全部微生物的核酸進行鑒定，可作為免疫功能受損人群病原體檢測的選擇［4］。既往有研究納入血、肺泡灌洗液、痰、尿等不同標本類型，泛標本探討mNGS 在血液腫瘤中的應用價值［5］。目前尚缺乏mNGS針對血液腫瘤患者血流感染的大型診斷效能研究。本研究觀察了外周血標本mNGS與常規檢測技術病原體檢出率的差異，探討了發熱血液腫瘤患者mNGS 細菌檢出陽性的獨立影響因素，并進一步構建了mNGS 細菌檢出陽性預測模型，為mNGS檢測時機的選擇提供指導。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2020 年6 月1 日—2022 年10 月30日在徐州醫科大學附屬醫院住院治療的發熱血液腫瘤患者104 例，男64 例（61.5%）、女40 例，年齡51.50（35.00，62.00）歲，血液病類型：白血病55 例、多發性骨髓瘤25 例、淋巴瘤20 例、再生障礙性貧血3例、骨髓增生異常綜合征1例，合并癥：肺部感染80例（76.9%）、低蛋白血癥62 例（59.6%）、骨髓抑制85 例（81.7%），粒細胞缺乏癥81 例（77.9%）。納入標準：年齡≥14 歲；發熱≥38 ℃；臨床確診血液腫瘤［診斷標準參照《血液病學診斷及療效標準》（第4版）］且未合并實體腫瘤。排除標準：血液標本無法采集或采集量不能滿足檢測要求；臨床資料不全者；實體腫瘤；自身免疫性疾病；已明確的非感染性發熱。本臨床研究滿足赫爾基辛宣言的要求，經徐州醫科大學附屬醫院倫理委員會批準，并免除研究對象的知情同意審查（XYFY2023-KL013-01）。

1.2 病原體檢測方法 mNGS 檢測方法：取成人外周血5 mL，以cfDNA 管（游離核酸保存管）6～37 ℃保存，運輸不超過5 d。使用去宿主試劑盒并使用二代微生物破壁儀進行血液樣本預處理，應用PCRfree技術無擴增建庫，DNA/RNA 抽提建庫試劑盒匹配illumine NGS 高通量測序平臺進行宏基因組文庫構建（包含 DNA/RNA 提取、RNA 逆轉錄、DNA/cDNA 片段化、末端補平、末端加 A、連接測序接頭、文庫純化等步驟），然后應用NGS 文庫定量試劑盒進行定量測試。病原微生物基因數據分析軟件Gentellix 自動分析數據，去人源后通過人源指數識別真/假陰性結果并生成檢測報告［6-7］。數據庫覆蓋25 000 + 微生物、2 000 + 耐藥基因。血液樣本均由杰毅生物有限公司進行DNA-mNGS 檢測及生物信息分析。mNGS 陽性標準：以報告中詳細結果列表為參考，若檢出微生物片段僅含疑似或人體共生微生物群，則判定 mNGS 結果為陰性［8］。根據 mNGS是否檢出細菌分為 mNGS 細菌檢出組（n=40）和 mNGS細菌未檢出組（n=64）。

常規檢測技術方法：細菌常規檢測技術包括需氧及厭氧的血培養［9］；真菌常規檢測技術包括真菌培養、真菌/霉菌涂片、 G 試驗、GM 試驗［10-11］；病毒常規檢測技術包括實時熒光定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）測定血漿中 EBV 和 CMV 的 DNA 水平［12］；其他常規檢測技術包括 PPD 試驗、痰抗酸染色、血結核桿菌斑點試驗（T-SPOT）、γ-干擾素釋放試驗（IGRAs）［13］； 十三項病原菌檢測（具體包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、嗜麥芽窄食單胞菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、肺結核分枝桿菌復合群、肺炎支原體、肺炎衣原體）及十一項病原菌檢測（具體包括肺炎支原體抗體、柯薩奇B 組病毒IgM 抗體、人呼吸道合胞病毒IgM 抗體、腺病毒IgM 抗體、A 型流感病毒IgM 抗體、B 型流感病毒IgM 抗體、人副流感病毒IgM 抗體、埃可病毒IgM抗體、EB病毒IgM抗體、血清淀粉樣蛋白測定、結核分枝桿菌IgM 抗體、結核分枝桿菌IgG 抗體）等［14］。血液標本均留取患者空腹狀態下的靜脈血。以上實驗室檢測由徐州醫科大學附屬醫院檢驗科檢測人員嚴格按照質控程序完成。

1.3 觀察指標及收集方法 從住院病歷中收集mNGS 細菌檢出組、mNGS 細菌未檢出組臨床資料，包括血常規、感染指標及合并的臨床事件（肺部感染、低蛋白血癥、骨髓抑制、粒細胞缺乏癥）。感染指標包括超敏 C-反應蛋白（hs-CRP）、降鈣素原（PCT）、血清鐵蛋白（SF）、白介素-6（IL-6）、D-二聚體（D-Dimer）。肺部感染參照mNGS 檢測前最近一次胸部CT 影像學結果［15］。低蛋白血癥定義為血漿白蛋白< 30 g/L。抗腫瘤藥物相關的骨髓抑制符合①同時符合②中任一條即可診斷：①有惡性腫瘤病史，近期進行抗腫瘤治療，如化療、靶向治療等；②成人外周血白細胞< 4.0 ×109／L 為白細胞減少癥；中性粒細胞絕對值<2.0×109／L 為中性粒細胞減少癥；血紅蛋白濃度降低至正常水平以下為貧血；血小板計數< 100 ×109／L為血小板減少癥［16］。

1.4 統計學方法 采用 SPSS24.0 統計軟件。計量資料經S-W檢驗正態性，符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料以 ［M（P25，P75）］表示，兩組間比較采用 Mann-WhitneyU檢驗。計數資料用頻次（%）表示，兩組比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗或Fisher's確切概率法分析。采用二元 Logistic 回歸進行單因素分析，將P<0.05的指標及臨床事件納入 Logistic 多因素分析，尋找發熱血液腫瘤患者mNGS 細菌檢出陽性的獨立影響因素，并建立mNGS 細菌檢出陽性預測模型。采用ROC 分析mNGS 細菌檢出陽性預測模型的預測效能。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 發熱腫瘤患者中，mNGS 檢測技術與常規檢測技術病原體檢出率比較 發熱腫瘤患者中，mNGS與常規檢測技術細菌檢出陽性分別為40（38.5%）、7例（6.7%），兩者細菌檢出陽性率比較，χ2=29.934，P<0.05；病 毒 檢 出 分 別 為55（52.9%）、15 例（14.4%），兩者病毒檢出率比較，χ2=34.451，P<0.05；發熱腫瘤患者中，mNGS 對分枝桿菌、支原體/衣原體/立克次體、真菌檢出的例數分別為12（11.5%）、4（3.8%）、1 例（1%），常規檢測技術分別為7（6.7%）、0、0例，兩者比較，P均>0.05。

2.2 發熱腫瘤患者中mNGS 細菌檢出陽性的影響因素 發熱腫瘤患者中mNGS 細菌檢出組WBC、NEU、LY、hs-CRP、PCT、SF、IL-6、D-Dimer 分別為0.50（0.10，2.90）×109/L、0.16（0.00，1.88）×109/L、0.20（0.00，0.60）×109/L、130.20（39.13，218.95）mg/L、0.46（0.17，2.57）ng/mL、1 981.50（1 230.50，3 143.00）ng/mL、94.94（41.36，188.00）pg/mL、1.09（0.57，2.14）μg/mL，合并肺部感染、低蛋白血癥、骨髓抑制、粒細胞缺乏癥分別為37（92.5%）、33（82.5%）、37（92.5%）、34例（85.0%）；mNGS細菌未檢出組WBC、NEU、LY、hs-CRP、PCT、SF、IL-6、D-Dimer分 別 為2.00（0.70，5.15）×109/L、0.82（0.09，2.81）×109/L、0.40（0.10，1.05）×109/L、43.40（9.20，92.70）mg/L、0.17（0.10，0.54）ng/mL、2 498.50（1 381.25，4 002.75）ng/mL、66.56（10.83，172.00）pg/mL、1.45（0.70，2.38）μg/mL，合并肺部感染、低蛋白血癥、骨髓抑制、粒細胞缺乏癥分別為43（67.2%）、29（45.3%）、48（75.0%）、47例（73.4%）。

以 mNGS 細菌檢出陽性為因變量，上述各指標為自變量，行單因素 Logistic 回歸分析。結果顯示，hs-CRP 升高、合并肺部感染、合并低蛋白血癥、合并骨髓抑制是發熱腫瘤患者中mNGS細菌檢出陽性的影響因素，詳見表1。

表1 發熱腫瘤患者中mNGS 細菌檢出陽性率影響因素的單因素 Logistic 分析結果

采用逐步向后回歸法，引入標準為P<0.05，刪除標準為P>0.10，建立多因素Logistic 回歸模型。結果顯示， hs-CRP 高 、存在肺部感染、合并低蛋白血癥是 發熱腫瘤患者mNGS 細菌檢出陽性的獨立影響因素（P<0.05），結果見表2。

表2 發熱腫瘤患者中mNGS細菌檢出陽性率影響因素的多因素 Logistic 分析結果

2.3 mNGS細菌檢出陽性預測模型構建及效能驗證結果 依據獨立預測指標建立回歸方程，得出發熱腫瘤患者mNGS細菌檢出陽性預測模型（PRE）=-4.768+ 0.01×hs-CRP + 1.619×肺部感染 + 1.271×低蛋白血癥（合并肺部感染、合并低蛋白血癥為1） 。PRE預測發熱腫瘤患者mNGS 細菌檢出陽性的ROC（圖1）下面積AUC（95%CI）為 0.822（0.737～0.907）、Cut-off值0.415、約登指數0.551 靈敏度78.9%、特異度76.2%。hs-CRP預測發熱腫瘤患者mNGS 細菌檢出陽性的AUC（95%CI）為0.737（0.635～0.839）、Cut-off值147.400、約登指數0.395、靈敏度47.4%、特異度92.1%。合并肺部感染預測發熱腫瘤患者mNGS細菌檢出陽性的AUC（95%CI）為0.627（0.520～0.733）、Cutoff 值0.500、約登指數 0.253、靈敏度92.5%、特異度32.8%。合并低蛋白血癥預測發熱腫瘤患者mNGS 細菌檢出陽性的AUC（95%CI）為0.686（0.583～0.789）、Cut-off值0.500、約登指數0.372、靈敏度82.5%、特異度54.7%。

圖1 PRE及各獨立影響因素對發熱腫瘤患者mNGS細菌檢出陽性預測的ROC

3 討論

血液腫瘤患者是發生血流感染的高危人群，發熱常提示感染存在。然而血液腫瘤患者合并的發熱是感染性疾病導致，還是腫瘤自身導致，往往難以第一時間鑒別［2］。感染指標，如CRP、PCT等，特異性不強［3］。傳統病原體檢測，如血培養、抗原抗體檢測、病毒定量檢測等，各有其局限性。mNGS可作為 發熱血液腫瘤患者尋找病原體的新選擇。既往喬薇等［17］研究表明，mNGS鑒定病原體的陽性率顯著高于血培養（47.9%比1.41%，P<0.05）。本研究發熱血液腫瘤患者 mNGS 細菌檢出陽性率顯著高于血培養（38.5%比6.7%）；mNGS 病毒檢出率顯著高于傳統病原學檢測（52.9%比14.4%）。說明mNGS 比常規檢測技術檢出細菌及病毒更高效。

發熱血液腫瘤患者由于治療常需經驗性應用抗生素，導致血培養陽性率進一步下降［18-19］。既往研究［20］收集免疫功能正常合并嚴重膿毒癥表現的成年人 325例，結果顯示抗菌治療 120 min后，血培養陽性率較抗菌治療前降低 12.0%。另一項研究［21］分析了 559 例膿毒癥患者，接受抗生素治療后血培養陽性率下降了22.9% 。GIRMENIA等［22］發現，革蘭陰性菌血流感染是造血干細胞移植患者 4 個月時死亡率增加的獨立影響因素。GILL等［23］研究顯示，細菌血流感染使異體造血干細胞移植患者 1年總生存期顯著下降 。既往研究［24］顯示，當抗生素治療后血培養結果陰性時，mNGS仍能夠識別病原體。本研究104例 發熱血液腫瘤患者均行經驗性抗生素治療，其常規檢測技術陽性率僅6.73%，而mNGS 的 細菌檢出陽性率38.5%，mNGS細菌血流感染檢出率高于常規檢測技術（血培養）。

血液腫瘤患者化療導致骨髓抑制，免疫功能下降，使得WBC、NEU、LY 水平低下，極易發生感染。一旦細菌感染，hs-CRP、PCT 反應性升高［3］，而由于骨髓抑制等原因WBC、NEU 升高水平不理想。細菌感染，消耗血清中的蛋白質，導致白蛋白水平下降，甚至是低蛋白血癥。本研究顯示，hs-CRP 升高、合并肺部感染、合并低蛋白血癥、骨髓抑制是 mNGS細菌檢出陽性的影響因素。hs-CRP 升高、合并肺部感染、合并低蛋白血癥是 mNGS 細菌檢出陽性的獨立影響因素，并以此建立發熱血液腫瘤患者 mNGS細菌檢出陽性的預測模型，以選擇mNGS檢測時機，提高檢測效率。發熱血液腫瘤患者常已行病毒定量檢測，且經驗性抗病毒治療［19］。mNGS 擴大病毒檢測范圍，對臨床病情和治療影響不太大，故本研究并未針對病毒建立預測模型。

總之，在發熱血液腫瘤患者中，mNGS 細菌及病毒檢出率高于常規檢測技術。綜合hs-CRP 升高、合并肺部感染、合并低蛋白血癥成功建立了mNGS 細菌檢出陽性預測模型。本研究尚存在以下局限性：單中心研究，納入樣本量相對有限，可能會影響結果的準確性；回顧性研究，樣本采集前大多數患者存在抗菌藥應用史，可能存在滅活病原菌的DNA，影響檢測結果；本研究未進行RNA病原體檢測。