脂質納米粒載體共遞送抗原和雷西莫特佐劑對黑色素瘤小鼠細胞免疫應答及瘤體生長的影響*

金育, 羅佳, 何春艷, 羅忠瑞, 張玉芳, 劉野

(中國醫學科學院 & 北京協和醫學院 醫學生物學研究所, 云南 昆明 650118)

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物和細胞來源 6～8周齡C57BL/6雌性小鼠30只,體質量18～22 g,購自中國醫學科學院醫學生物學研究所,無特定病原體(specific pathogen free,SPF)條件下飼養,定期更換墊料、添加食物與飲用水,所有動物實驗均經中國醫學科學院醫學生物學研究所動物倫理委員會批準(DWSP202203032);小鼠黑色素瘤細胞B16F10-OVA來自國家納米科學中心。

1.1.2主要試劑和儀器 Liposome Kit(美國Sigma-Aldrich公司),Zombie NIRIM Fixable Viability Kit和流式染色抗體(美國Biolegend公司),Cytofix/Cytoperm固定破膜試劑(美國BectonDickinson公司),腫瘤疫苗多肽(氨基酸序列為SMLVLLPDEVSGLEQLESIINFEKLTEWTS;合肥國肽生物有限公司),磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)、改良Eagle(Dulbecco's modified Eagle medium,DMEM)高糖培養基、雙抗、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS;美國Gibco公司);細胞計數板(江蘇求精新材料集團),70 μm細胞濾網(中國Biosharp公司),水平離心機和流式細胞儀(美國Beckman公司),CO2培養箱(美國Thermo Scientific公司),T75培養瓶(無錫耐思生物科技有限公司)。

1.2 研究方法

1.2.1黑色素瘤細胞培養 小鼠黑色素瘤B16F10-OVA細胞于含有10% FBS,105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養基中,37 ℃、5%CO2恒溫細胞培養箱內培養,每2～3 d傳代1次。

1.2.2小鼠造模、分組及免疫 取“1.2.1”項下對數生長期細胞制作成2×1010個/L細胞懸液,接種于小鼠右側前肢皮下,200 μL /只,30 min內接種完畢,7 d后觀察腫瘤形成情況,以確定造模成功。取造模成功小鼠隨機均分為空白(Blank)組(生理鹽水100 μL)、LNP+抗原組(腫瘤疫苗多肽50 μg和LNP 10 μg 混合配成終體積為100 μL的混合液,現配現用)、LNP+R848組(LNP 10 μg和R848 3.18 μg混合配成終體積為100 μL的混合液,現配現用)、R848+抗原組(腫瘤疫苗多肽50 μg和R848 3.18 μg混合配成終體積為100 μL的混合液,現配現用)及LNP+R848+抗原組(腫瘤疫苗多肽50 μg、LNP 10 μg及R848 3.18 μg混合配成終體積為100 μL的混合液,現配現用),2次免疫,間隔7 d。

1.2.3瘤體測量 “1.2.2”項下各組小鼠免疫處理期間每隔1 d測量腫瘤的長徑(length,L)、短徑(width,W),并依此計算腫瘤體積[volume,V;V=(L×W2)/2]。

1.2.4腫瘤細胞的制備 “1.2.2”項下各組小鼠第2次免疫后第7天麻醉處死,取出瘤體,于生物安全柜中用滅菌剪刀剪碎,置于70 μm細胞濾網研磨、過濾,收集細胞懸液至離心管;每管加紅細胞裂解液5 mL,輕輕震蕩混勻,裂解時間不超過5 min,加 PBS 5 mL終止裂解,混勻離心;加PercollTM分離液離心分離細胞,4 ℃、1 800 r/min離心30 min,吸出表面黑色液體,加DMEM高糖培養基10 mL重懸洗滌細胞,4 ℃、1 800 r/min離心10 min,棄上清,收集細胞計數備用。

1.2.5腫瘤CD8陽性T淋巴細胞(CD8+T)和CD4+T細胞的檢測 取“1.2.4”項下細胞1×109個/L到96孔板,加5 mg/L腫瘤疫苗多肽刺激6 h進行染色分析;使用Zombie NIRTM染色(0.1 μL /孔),室溫避光孵育15 min,以評估細胞的生存能力;2% FBS/PBS洗滌,加CD45-Brilliant Violet 605、CD3-Brilliant Violet 510、CD4-Fluoresceine Isothiocyanate、CD8-Alexa Fluor 700及CD107a-Phycoerythrin流式染色抗體,4 ℃避光孵育30 min,2% FBS/PBS洗滌細胞;加固定破膜液,4 ℃避光孵育30 min,用Permeabilization Wash buffer洗2次;加干擾素γ(interferon γ,IFN-γ )-Allophycocyanin抗體、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)-Preactivated PerCP-Cy5.5 Maleimide抗體,4 ℃避光孵育30 min,用Permeabilization Wash buffer洗滌細胞,重懸細胞轉移至流式管后上機進行檢測;使用FlowJo軟件對數據進行分析。

1.3 統計學分析

使用GraphPad Prism 9軟件進行統計分析,3組及以上比較采用單因素方差分析,2組間比較用t檢驗來檢測顯著性;P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腫瘤生長情況

免疫期間,各組小鼠腫瘤生長結果顯示(圖1),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤生長較慢,且免疫后第12天 ,腫瘤體積分別小于Blank組、LNP+抗原組、LNP+ R848組及R848+抗原組,差異均有統計學意義(P<0.05)。

注： (1)與同時點Blank組比較,P<0.05;(2)與同時點LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與同時點LNP+R848組比較,P<0.05;(4)與同時點抗原+R848比較,P<0.05。

2.2 CD4+T細胞分泌CD107a的水平

流式細胞術分析結果顯示(圖2),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤組織中CD4+T細胞分泌的CD107a分別高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,差異均有統計學意義(P<0.05),表明該組小鼠T細胞活化程度增高。

注：A為流式細胞儀檢測結果,B為定量結果; (1)與Blank組比較,P<0.05;(2)與LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與LNP+ R848組比較,P<0.05;(4)與抗原+R848組比較,P<0.05。

2.3 CD8+T細胞分泌CD107a的水平

流式細胞術分析結果顯示(圖3),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤組織中CD8+T細胞分泌的CD107a高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,差異均有統計學意義(P<0.05),表明該組小鼠腫瘤組織中T細胞活化程度增高。

注：A為流式細胞儀檢測結果,B為定量結果;(1)與Blank組比較,P<0.05;(2)與LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與LNP+ R848組比較,P<0.05;(4)與抗原+R848組比較,P<0.05。

2.4 CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌IFN-γ的水平

流式細胞術分析結果顯示(圖4和圖5),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌IFN-γ的水平高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,差異均有統計學意義(P<0.05),表明該組小鼠的T細胞在受到疫苗刺激后可產生更高水平的抗原特異性免疫保護。

注：A、B、C、D及E為流式細胞儀檢測結果,F為流式細胞儀定量結果; (1)與同時點Blank組比較,P<0.05;(2)與同時點LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與同時點LNP+R848組比較,P<0.05;(4)與同時點抗原+R848比較,P<0.05。

注：A、B、C、D及E為流式細胞儀檢測結果,F為流式細胞儀定量結果; (1)與同時點Blank組比較,P<0.05;(2)與同時點LNP+抗原組比較,P<0.05;(3)與同時點LNP+ R848組比較,P<0.05;(4)與同時點抗原+R848組比較,P<0.05。

2.5 CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌TNF-α的水平

流式細胞術分析結果顯示(圖6和圖7),LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤組織中CD4+T細胞和CD8+T細胞分泌TNF-α的水平高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,差異均有統計學意義(P<0.05),表明LNP對R848和抗原的共遞送可以刺激T淋巴細胞產生更高水平的抗原特異性的細胞免疫效應。

3 討論

腫瘤疫苗利用腫瘤特異性抗原觸發T細胞介導抗腫瘤免疫反應。腫瘤疫苗靶向腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原,通過活化CD8+T細胞達到初步激活主動免疫殺傷癌細胞的作用。而后裂解的癌細胞又會釋放不同種類的腫瘤抗原經抗原提呈細胞[例如:樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)]提呈給T細胞,進而引發更為廣泛的抗腫瘤應答[15]。腫瘤疫苗的類型可以分為:肽段疫苗、樹突細胞疫苗、核酸疫苗[信使RNA(message RNA,mRNA)或者DNA疫苗]、病毒疫苗以及原位腫瘤疫苗[16]。目前抗腫瘤疫苗的研發面臨著以下幾個難點:疫苗分子的選擇、遞送系統的選擇、腫瘤微環境的改善等[17]。在提高疫苗有效性方面,一種已經開始使用的方法是將腫瘤疫苗與一些免疫刺激劑共用,來提高疫苗的有效性。另一方面,疫苗的遞送系統在腫瘤疫苗系統中有著重要的作用,需要對人體傷害小,更容易降解的載體材料。除此之外,有些疫苗本身穩定性差,需要遞送系統能夠更穩定的裝載,讓抗原能夠長期耐高溫的儲存,在體內時抗原能夠長期表達,更好地刺激免疫細胞[18]。

本研究利用黑色素瘤特異性抗原多肽制備多肽腫瘤疫苗,以R848作為佐劑,增強其免疫原性,并選擇LNP作為遞送載體,探索設計的腫瘤疫苗在黑色素瘤小鼠模型上的免疫效果。

在自然殺傷(natural killer, NK)細胞和細胞毒性T細胞(cytotoxic T cell, CTL)中,CD107a是溶細胞顆粒中最豐富的蛋白質之一,它位于囊泡膜的內側,介導蛋白經溶酶體途徑的分選[19]。CD107a可以用來評價NK細胞或者T細胞活性的原因就是:一旦顆粒到達NK/T細胞的漿膜面,顆粒膜與細胞膜發生融合,CD107a隨即暴露在細胞膜表面,這被認為是一種保護效應細胞(NK/T細胞)免受脫顆粒相關的自殺機制[20-22]。目前研究表明,CD107a分子的膜表達可以直接反映NK細胞或者CTL的脫顆粒過程,從而反映其殺傷功能。IFN-γ是抗腫瘤免疫相關的關鍵細胞因子,通過誘導凋亡、或者非凋亡細胞死亡來殺傷腫瘤細胞;還可通過巨噬細胞活化、上調抗原處理及呈遞分子的表達等方式發揮抗腫瘤的作用[23-24]。TNF-α是一種主要由活化的巨噬細胞、T淋巴細胞分泌的多功能性細胞因子,參與機體炎癥反應和免疫調控,在自身免疫性疾病、腫瘤等疾病的發生發展中發揮不可忽視的作用[25-26]。本研究以LNP為載體,引入TLR7/8的激動劑R848,構建了具有高免疫原性的LNP-R848佐劑共遞送系統,并在小鼠黑色素瘤模型上進行驗證,利用流式細胞術檢測腫瘤組織細胞中CD4+T細胞及CD8+T細胞分泌CD107a、IFN-γ和TNF-α的水平,結果表明,LNP+R848+抗原組小鼠腫瘤細胞中CD4+T細胞及CD8+T細胞分泌CD107a、IFN-γ和TNF-α的水平高于Blank組、LNP+抗原組、LNP+R848組及R848+抗原組,說明該疫苗能通過增強T細胞反應抑制腫瘤生長。本研究結果表明,佐劑共遞送是增強腫瘤疫苗免疫效果的有效策略。

綜上所述,本研究開發了一種腫瘤疫苗的設計策略,利用LNP遞送腫瘤抗原和免疫佐劑R848,能有效增強T細胞免疫反應,顯著抑制小鼠黑色素瘤的生長,在增強腫瘤疫苗性能方面具有很大的潛力。