貴州天名精全草中乙酸乙酯部位化學成分的分離鑒定*

陳潔, 王丹, 張雄, 彭明友, 晏英,, 湯磊, 王穎,***

(1.貴州醫科大學 藥學院, 貴州 貴陽 550025; 2.貴州醫科大學 貴州省化學合成藥物研發利用工程技術研究中心, 貴州 貴陽 550004)

天名精屬(Carpesium)為菊科(Compositae)植物,多年生草本,該屬在全世界約有21個種,在我國的西南片區有豐富的植物資源,主要品種有天名精C.abrotanoidesLinn.、貴州天名精C.faberiWinkl.、煙管頭草C.cernuumL.及金挖耳C.divaricatumSieb. et Zucc.等[1]。Carpesium植物的根、莖、葉子及其果實都在民間長期入藥,具有解毒清熱、止血祛痰以及殺蟲等功效[2]。自1949年有學者開始對Carpesium化學成分進行研究,迄今為止,已從該屬植物中分離到至少306個化合物,結構類型包括倍半萜內酯類化合物、黃酮類化合物及芳香族類化合物等[3-4]。經過藥理活性評估,發現從Carpesium中所得的某些單體化合物具有抗腫瘤、抗瘧原蟲、抗炎、抗菌等多種生物活性[5-8],目前對天名精、金挖耳的研究相對較多,也得到了不錯的成果[2],但對貴州天名精的研究相對較少,本研究將其作為研究對象,對其化學成分進行鑒定。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1植物來源 貴州天名精樣品采自貴州省凱里市,經過貴州中醫藥大學孫慶文老師鑒定為貴州天名精(Carpesiumfaberi),憑證標本(TMJ 201909)保存于貴州醫科大學藥學實驗室。

1.1.2主要試劑與儀器 色譜級甲醇、乙腈(科密歐試劑公司),核磁用氘代試劑(美國CIL氘代試劑);柱層析所用硅膠為200～300目(煙臺江友硅膠開發有限公司),C18反相硅膠(日本YMC公司),色譜柱Waters sunfire C18(美國Waters公司),旋轉蒸發儀(東京理化公司),SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(北京市泰和格潤儀器有限公司),Bruker HTC/Esquire質譜儀(德國布魯克公司),高效液相色譜儀為Agilent 1260型(美國安捷倫公司),Xevo G2-XS型四極桿-飛行時間質譜儀(美國Waters公司),HH-2數顯恒溫水浴鍋(貴州澳華儀器有限公司),UP-Ⅱ優譜系列超純水機(四川優譜超純科技有限公司),Bruker AV-600 MHz核磁共振儀(德國布魯克公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1乙酸乙酯層初步分離 將貴州天名精全草30 kg切碎,乙醇浸泡提取48 h,所得的浸膏于通風櫥中揮發干直至無醇味,得浸膏12 kg;使用乙酸乙酯進行萃取3次,萃取液蒸發濃縮、風干,得浸膏1.5 kg;浸膏充分溶解,使用石油醚濕法裝柱,敲打柱體,石油醚反復沖洗,待液面自然沉降至與硅膠面基本相平時,上樣,使用石油醚-乙酸乙酯(50∶1至0∶1)系統對樣品進行梯度洗脫,經薄層色譜法(thin-layer chromatography,TLC)檢測,合并相似流分,共得10個組分,記為Fr1～Fr10。

1.2.2樣品Fr5的分離 Fr5(67.5 g)經小孔樹脂柱層析(甲醇-水50%至100%)得到8個亞流分,記為Fr5-1～Fr5-8;Fr5-2經反相柱(甲醇-水20%至100%),得到16個亞流分,記為Fr5-2A～Fr5-2P;Fr5-2D經凝膠柱(100%甲醇)得到5個亞流分,記為Fr2D-1～Fr2D-5;Fr2D-4經正相硅膠柱(石油醚∶二氯甲烷 20∶1至0∶1),得到Fr2D-4A經過制備型TLC的到化合物2(10 mg);Fr5-2I經正相硅膠柱(石油醚∶乙酸乙酯 20∶1至2∶1),8個亞流分,記為Fr2I-1～Fr2I-8;Fr2I-6經制備型TLC,得到化合物3(7.5 mg)。

1.2.3樣品Fr6的分離 Fr6經過MCI柱(甲醇-水30%至100%),得到17個亞流分記為Fr6A～Fr6P,Fr6M經硅膠柱(石油醚∶乙酸乙酯 8∶1至0∶1)得到亞流分Fr6M-2,經過凝膠柱(100%甲醇),得到亞流分Fr6M-2A經過制備型高效液相色譜儀(preparative high performance liquid chromatography,PHPLC,流動相為70%乙腈-水,流速2.0 mL/min,保留時間32 min)得化合物5(10 mg);Fr6O經硅膠柱(石油醚∶乙酸乙酯10∶1至0∶1)得到亞流分Fr6O-4,經PHPLC(流動相為90%甲醇-水,流速2.0 mL/min,保留時間25 min)得到化合物6(8 mg)。

1.2.4樣品Fr7的分離 Fr7樣品經混合溶劑溶解,二氯甲烷濕法裝柱,用二氯甲烷∶甲醇(100∶0至0∶1)系統對樣品進行梯度的洗脫,所得的流分經TLC檢測后,將相似的流分合并,得到9個亞流分,記為Fr7A～Fr7I,其中Fr7E部分經過小孔樹脂柱層析(甲醇-水30%至100%),得到13個亞流分,記為Fr7E-1～Fr7E-13;Fr7E-10經反相(甲醇-水40%至100%),得到16個亞流分,記為FrE10-A～FrE10-P;FrE10-H經凝膠柱(100%甲醇),得到6個亞流分,記為Fr10H-1～Fr10H-6;Fr10H-4經正相硅膠柱(石油醚∶乙酸乙酯5∶1至0∶1),得到10個亞流分,記為FrH4-1～FrH4-10;FrH4-4經PHPLC(流動相為38%甲醇-水,流速2.0 mL/min,保留時間33 min)得到化合物8(7.8 mg);FrH4-8經PHPLC(流動相為38%甲醇-水,流速2.0 mL/min,保留時間33 min)得到化合物9(15.1 mg);FrE11-E經過硅膠柱(石油醚∶乙酸乙酯 20∶1至5∶1)得到亞流分Fr11E-2,經PHPLC(流動相為95%甲醇-水,流速2.0 mL/min,保留時間35 min)得到化合物7(14 mg);Fr7F-6F經凝膠柱(100%甲醇),得到亞流分Fr6F-1、Fr6F-2;Fr6F-1經PHPLC(流動相為52%甲醇-水,流速1.3 mL/min,保留時間25 min)得到化合物1(14.5 mg);Fr6F-2經過硅膠柱(石油醚∶丙酮 30∶1至5∶1)得到亞流分Fr6F-2B,經PHPLC(流動相為48%甲醇-水,流速2 mL/min,保留時間37 min)得到化合物4(9 mg)。

2 結果

2.1 化合物1

無定形粉末;ESI-MS為m/z225 [M+H]+(C13H20O3);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ為7.02(1H,d,J= 15.6 Hz,H-7),6.28(1H,d,J= 15.6 Hz,H-8),3.89(1H,d,J= 4.2 Hz,H-3),2.38(1H,ddd,J=14.4,4.8,1.2 Hz,H-4α),2.27(3H,s,H-10),1.66(1H,d,J= 9.0 Hz,H-4β),1.64(1H,m,H-2α),1.27(1H,dd,J= 10.2,2.6 Hz,H-2β),1.19(6H,s,H-12,13),0.97(3H,s,H-11);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ為197.4(C-9),142.4(C-7),132.6(C-8),69.5(C-6),67.3(C-5),64.0(C-3),46.6(C-2),40.6(C-4),35.1(C-1),29.3(C-12),28.3(C-10),24.9(C-11),19.8(C-13)。鑒定化合物1為3β-羥基-5α,6α-環氧-7-大柱香波龍烯-9-酮。化學結構式如圖1所示。

2.2 化合物2

淡黃色油狀物;ESI-MS為m/z269 [M+H]+(C14H20O5);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ為6.91(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.71(1H,s,H-2),6.65(1H,dd,J=8.0,1.0 Hz,H-6),4.53(1H,d,J=12.0 Hz,H-9α),4.43(1H,d,J=12.0 Hz,H-9β),3.87(1H,d,J=12.0 Hz,H-10α),3.79(1H,d,J=12.0 Hz,H-10β),2.57(1H,dt,J=14.0, 7.0 Hz,H-2′),2.27(3H,s,H-7),1.13(3H,d,J=4.2 Hz,H-3′),1.12(3H,d,J=4.2 Hz,H-4′);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ為178.5(C-1′),156.8(C-3),140.3(C-1),126.4(C-2),120.8(C-5),119.7(C-4),118.9(C-6),79.2(C-8),67.7(C-9),66.1(C-10),34.2(C-2′),21.2(C-7),19.1(C-3′),19.0(C-4′)。鑒定化合物2為8,10-二羥基-9-異丁酰基百里香酚。化學結構式如圖1所示。

2.3 化合物3

無色油狀物;ESI-MS為m/z361 [M+Na]+(C18H26O6);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ為6.89(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),6.70(1H,s,H-2),6.64(1H,dd,J=8.0,1.1 Hz,H-6),4.45(4H,q,J=12.0 Hz,H-9,10),2.56(2H,dt,J=14.0,7.0 Hz,H-2″,2′),2.27(3H,s,H-7-CH3),1.13(12H,dd,J=6.6,0.6 Hz,H-3′,4′,3″,4″);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ為177.7(C-1′,C-1″),156.9(C-5),140.3(C-1),126.7(C-3),120.7(C-6),119.0(C-2),118.8(C-4),79.0(C-8),67.5(C-9,10),34.1(C-2′,2″),21.2(C-7),19.0(C-3′,4′,3″,4″)。鑒定化合物3為8-羥基-9,10-二異丁酰氧基麝香草酚。化學結構式如圖1所示。

2.4 化合物4

無定形粉末;ESI-MS為m/z197 [M+H]+(C11H16O3);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ為5.69(1H,s,H-6),4.32(1H,d,J=2.4 Hz,H-2),2.46(1H,dt,J=13.8,2.4 Hz,H-3β),1.98(1H,dt,J=14.4,2.4 Hz,H-1β),1.79(1H,s,H-3α),1.76(3H,m,H-11),1.52(1H,dd,J=14.6,3.8 Hz,H-1α),1.46(3H,s,H-9),1.27(3H,s,H-10);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ為182.5(C-5),172.0(C-7),112.9(C-6),86.7(C-4),66.8(C-2),47.3(C-1),45.6(C-3),35.9(C-8),30.6(C-10),27.0(C-11),26.5(C-9)。鑒定化合物4為毛脈五味子醇。化學結構式如圖1所示。

2.5 化合物5

無色油狀;ESI-MS為m/z309 [M+H]+(C19H32O3);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ為6.51(1H,dd,J=15.0,10.8 Hz,H-14),5.97(1H,t,J=10.8 Hz,H-15),5.69(1H,dd,J=15.2,6.4 Hz,H-13),5.57(1H,m,H-9),5.43(1H,dt,J=10.8,7.6 Hz,H-16),5.36(1H,m,H-10),4.21(1H,d,J=3.6 Hz,H-12),3.66(3H,s,O-CH3),2.35(2H,m,H-11),2.29(2H,d,J=7.6 Hz,H-2),2.17(2H,q,J=7.8 Hz,H-17),2.07(2H,m,H-8),0.97(3H,t,J=7.8 Hz,H-18);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ為174.6(C-1),135.5(C-9),135.2(C-14),133.1(C-13),128.0(C-115),126.1(C-16),124.0(C-10),72.3(C-10),51.7(-OCH3),35.5(C-11),34.3(C-2),29.7(C-4),29.3(C-5,6),29.2(C-7),27.9(C-8),25.1(C-3),21.0(C-17),14.4(C-18)。鑒定化合物5為(9Z,12S,13E,15Z)-12-Hydroxyoctadeca-9,13,15-trienoic-acid-methyl-ester。化學結構式如圖1所示。

2.6 化合物6

淡黃色油狀;ESI-MS為m/z297 [M+H]+(C20H40O);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ為5.40(1H,m,H-2),4.14(2H,m,H-1),1.98(2H,m,H-4),1.67(3H,s,H-20),1.52(1H,m,H-15),1.25(2H,dd,J=6.8, 3.4 Hz,H-7,11),0.86(6H,d,J=6.8 Hz,H-16,17),0.85(3H,d,J=4.4 Hz,H-18),0.84(3H,d,J=4.4 Hz,H-19);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ為140.6(C-3),123.3(C-2),59.7(C-1),40.1(C-4),39.6(C-14),37.7(C-10),37.6(C-8),37.5(C-12),36.9(C-6),33.0(C-11),32.9(C-7),28.2(C-15),25.4(C-5),25.0(C-13),24.7(C-9),22.9(C-17),22.8(C-16),20.0(C-19),19.9(C-18),16.4(C-20)。鑒定化合物6為植醇。化學結構式如圖1所示。

2.7 化合物7

淡黃色油狀物;ESI-MS為m/z237 [M+Na]+(C15H26O2);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ為4.74(1H,s,H-12a),4.73(1H,s,H-12b),3.65(2H,s,H-5),2.40(1H,m,H-1),2.35(2H,m,H-7),2.11(3H,s,CH3-15),2.05(2H,m,H-3),1.86(1H,dd,J=16.6,8.4 Hz,H-9),1.80(1H,m,H-10α),1.70(2H,dd,J=14.4,6.6 Hz,H-4),1.64(2H,dd,J=6.6,2.4 Hz,H-8),1.44(1H,s,H-10β),1.04(3H,s,CH3-14),1.03(3H,s,CH3-13);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ為209.3(C-6),152.5(C-2),107.4(C-12),63.0(C-5),48.2(C-9),42.3(C-7),41.6(C-1),40.0(C-10),33.8(C-11),31.3(CH3-14),31.1(C-4),31.1(C-3),30.1(C- CH3-15),24.9(C-8),22.6(C-13)。鑒定化合物7為5-hydroxy-5,6-secocaryophyllen-6-on。化學結構式如圖1所示。

2.8 化合物8

無色結晶;ESI-MS為m/z411 [M+Na]+(C21H24O7);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ為6.90(1H,s,H-2),6.89(1H,d,J=5.0 Hz,H-5),6.82(1H,dd,J=8.2,1.6 Hz,H-6),6.58(2H,s,H-2′,6′),5.61(1H,s,H-7′),5.50(1H,s,H-7),4.73(2H,dd,J=17.4,4.6 Hz,H-9β,9β′),4.26(2H,ddd,J=15.6,9.2,6.6 Hz,H-9α,9α′),3.90(9H,m,H-3,3′,5′-OCH3),3.10(2H,m,H-8,8′);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ為147.1(C-5′,3′),146.7(C-3),145.2(C-4),134.3(C-4′),132.9(C-1),132.1(C-1′),118.9(C-6),114.3(C-5),108.6(C-2),102.7(C-2′,6′),86.1(C-7′),85.8(C-7),71.9(C-9′),71.6(C-9),56.4(C-3′OCH3,C-5′OCH3),56.0(C-3OCH3),54.4(C-8′),54.1(C-8)。鑒定化合物8為5′-甲氧基松脂素。化學結構式如圖1所示。

2.9 化合物9

白色粉末;ESI-MS為m/z441 [M+Na]+(C22H26O8);1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ為6.58(4H,s,H-2,2′,6,6′),5.50(2H,s,H-4,4′-OH),4.73(2H,d,J=4.2 Hz,H-7,7′),4.28(2H,dd,J=9.2,6.8 Hz,H-9β,9′β),3.91(2H,d,J=3.6 Hz,H-H-9α,9′α),3.90(12H,s,H-3,3′,5,5′,-OCH3),3.09(2H,dd,J=6.4,4.8 Hz,H-8,8′);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ為147.2(C-3,3′,5,5′),134.3(C-4,4′),132.1(C-1,1′),102.7(C-2,2′,6,6′),86.1(C-7,7′),71.8(C-8,8′),56.4(C-9,9′),54.3(C-3,3′-OCH3)。鑒定化合物9為丁香樹脂素。化學結構式如圖1所示。

3 討論

菊科是雙子葉植物中最進化的植物類群,不僅屬種數最多,而且分布最廣,擁有特殊的生物學特性,可謂植物界中的世界冠軍;我國境內菊科植物約有240個屬、2 300個種;菊科植物性寒,味干苦,據記載其主要功效有清熱散風、解毒及明目,適用于感冒發熱、心煩苦悶等癥狀[9-11]。在菊科植物資源中,涵蓋很多重要的藥用植物、蔬菜作物、油料作物及觀賞植物,它們富含多樣的生物活性物質[12-13]。所以,菊科植物為活性化合物的發現提供了重要線索,具有潛在的研究價值。

天名精屬植物是一種廣泛應用的傳統藥材,長期被東南亞國家用于治療各種疾病[14]。貴州天名精作為本屬植物中藥用歷史悠久、應用廣泛的中草藥,具有清熱解毒、破瘀止血等功效,富含復雜多樣的天然活性產物,但其活性成分和作用機理尚不完全明確[6,15]。為了進一步充分利用藥用資源,發掘天名精屬植物的潛在價值,本課題組對貴州天名精開展了系統的化學成分研究,進而挖掘潛在活性有效成分,探究了其多樣化的生物功能[16-17]。

利用硅膠、MCI gel CHP 20P、葡聚糖凝膠LH-20、Rp-C18、制備薄層色譜、制備型以及半制備型HPLC等多種現代色譜分離手段從貴州天名精全草的乙酸乙酯層中分離9個化合物,使用波譜鑒定技術得到化合物波譜數據,結合波譜數據以及文獻報道對比,結合質譜儀確定化合物1～9的結構,分別為3β-羥基-5α,6α-環氧-7-大柱香波龍烯-9-酮(1)[18]、8,10-二羥基-9-異丁酰基百里香酚(2)[19]、8-羥基-9,10-二異丁酰氧基麝香草酚(3)[20]、毛脈五味子醇(4)[21]、(9Z,12S,13E,15Z)-12-Hydroxyoctadeca-9,13,15-trienoic-acid-methylester(5)[22]、植醇(6)[23]、5-hydroxy-5,6-secocaryophyllen-6-on(7)[24]、5′-甲氧基松脂素(8)[25]、丁香樹脂素(9)[26]。其中化合物1、4、5、7及9為首次從天名精屬植物中分離得到,化合物1為無內酯環倍半萜內酯類化合物,化合物2～4為單萜類化合物,化合物5～7為二萜類化合物,化合物8、化合物9為木脂素類化合物。

在分離過程中使用多種薄層色譜條件對樣品進行分析,對于極性大的Fr7部分的樣品,本研究找到的最佳薄層色譜條件為二氯甲烷:甲醇為25∶1,5%的硫酸乙醇為顯色劑,極性相對小的Fr5、Fr6部分的樣品,本研究找到的最佳薄層色譜條件為石油醚:乙酸乙酯為3∶1,5%的硫酸乙醇做為顯色劑。采種貴州天名精干燥全草30 kg,經95%乙醇提取、乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯層浸膏1.5 kg,樣品量較大,故本研究首先采用粗硅膠(100～200目)對樣品次進行劃段。因選擇貴州天名精的全草,色素含量較多,故本研究對硅膠柱下來的餾分再一次使用小孔樹脂進行分離,除去部分色素,以便進行薄層色譜分析時可更清楚地看見化合物的情況。根據薄層色譜情況,選擇葡聚糖凝膠LH-20、Rp-C18、正相硅膠柱、制備型HPLC等色譜柱條件對樣品進行更加細致分離,得到單體化合物。

綜上所述,本研究以民間傳統藥用植物作為切入點,探究植物貴州天名精中所含化學成分,不僅豐富了藥用植物貴州天名精中天然活性產物的多樣性,而且為后期其多種作用機制的研究奠定了基礎。