大分割電離輻射對鼻咽癌細胞共培養后的樹突狀細胞成熟狀態的影響*

龍金華, 曾憲琳, 金仙槐

(1.貴州醫科大學附屬腫瘤醫院 頭頸腫瘤科, 貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學 生物與工程學院, 貴州 貴陽 550004)

放療是一種破壞腫瘤細胞DNA、抑制腫瘤細胞增殖的治療方法,是鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)主要的臨床治療手段[1]。研究發現,放療劑量與腫瘤的治療效果密切相關[2],大分割放療可打破機體對腫瘤的免疫耐受,啟動特異性抗腫瘤免疫應答[3],但其具體機制不清。樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)作為一種特殊的抗原提呈細胞,具有強大的抗原攝取和提呈能力,發揮著連接先天和適應性免疫應答的作用[4]。DCs獲取腫瘤抗原后,從未成熟樹突狀細胞(immature dendritic cells, imDCs)向成熟樹突狀細胞(mature dendritic cells, mDCs)分化,并逐漸上調白細胞分化抗原80(cluster of differentiation 80, CD80)、CD83、CD86、人白細胞抗原DR(human leukocyte antigen DR, HLA-DR)以及CC基序趨化因子受體7(C-C motif chemokine receptor 7, CCR7)等分子表達[5]。有研究發現,DCs亞群和浸潤數量與NPC患者的生存呈顯著相關[6-7],提示DCs介導的抗腫瘤免疫應答在NPC治療中可能發揮著重要作用[8-10]。目前,NPC放療分割模式仍采用常規劑量(1.8～2.0 Gy)[11-12],大分割放射(>2.0 Gy)對NPC誘導的免疫應答類型尚不清楚。因此,本文研究經大分割(4 Gy和18 Gy)電離輻射照射的NPC細胞對imDCs的免疫表型分子、遷移能力以及環磷酸鳥苷-腺苷合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase, cGAS)和干擾素基因刺激蛋白(stimulator of interferon genes,STING)表達的影響,以期找到放療過程中DCs介導抗腫瘤免疫應答的啟動機制。

1 材料與方法

1.1 細胞來源、主要試劑與儀器

人5-8F NPC細胞株購于富衡生物,RPMI-1640培養基和胰蛋白酶均購于Gibco,重組人粒-巨噬細胞集落刺激因子(rhGM-CSF)和重組人白介素4(rhIL-4)細胞因子均購于PeproTech,胎牛血清購于Gemini Bio,HLA-DR、CD11c、CD80、CD83、CD86以及CCR7的特異性流式抗體均購于Biolegend,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)、cGAS及STING的特異性抗體均購于Abcam,直線加速器購于醫科達,核磁共振掃描儀購于西門子,流式細胞儀購于BD。

1.2 研究方法

1.2.1研究對象 選取2021年1月—2023年1月收治的134例NPC患者為NPC組,納入標準:(1)病理學確診的 NPC 患者,按 第 8 版美國癌癥聯合會/國際抗癌聯盟(American Joint Committee on Cancer/ Union for International Cancer Control, AJCC/UICC)腫瘤淋巴結轉移(tumor node metastasis, TNM) 分期標準分期(Ⅰ—Ⅵb);(2)治療前簽署放療知情同意書,無放療禁忌癥;(3)既往無頭頸部放射治療史;(4)預計生存期 6 個月以上,卡諾夫斯基的功能狀態(Karnofsky performance scale, KPS)評分≥70分;(5)患者對接受治療和隨訪有良好的依從性。排除標準:有嚴重感染或出血傾向者、合并嚴重且未控制的內科疾病、出現主要器官功能衰竭。健康對照組為153名健康志愿者,均排除鼻咽部相關疾病,無心肺等臟器疾病。本研究經醫院倫理委員會批準(批注號2020162),所有志愿者及患者簽署知情同意書。

1.2.2鼻咽部核磁共振檢查和流式外周血DCs數量分群 所有患者均按照ICRU 62號規范勾畫靶區,制定三維適形調強放療治療計劃,射線能量為 6 Mv X線,靶區的劑量為PGTVnx 72.6 Gy/33 f。放療結束后1周,對患者行鼻咽部核磁共振檢查。外周血流式細胞檢測外周血DCs數量分群[髓系DCs(CD11c+myeloid DCs,MDCs)和漿系DCs(CD123+plasmacytoid DCs,PDCs)]。

1.2.3細胞培養和放射處理 5-8F人NPC細胞:用含10%FBS的RPMI-1640培養基培養于37 ℃、5%CO2的細胞培養箱中,待細胞密度生長至80%～90%,進行傳代培養或使用輻照儀進行放射處理,放療劑量為4 Gy和18 Gy。imDCs的分離培養:密度梯度離心法從健康人外周血中分離單核細胞,用含10% FBS、150 μg/L rhGM-CSF和100 μg/L rhIL-4的RPMI-1640培養基培養5 d,將其誘導分化為imDCs。

1.2.4NPC細胞與imDCs共培養 5-8F NPC細胞照射后繼續常規培養48 h,收集其培養上清,制成條件培養基。收集imDCs,用含20% FBS的RPMI-1640培養基調節細胞密度為2×106個/mL,每孔加入細胞懸液1 mL和條件培養基1 mL (imDCs+4 Gy、imDCs+18 Gy)設為imDCs+4 Gy組和imDCs+18 Gy組,陰性對照(imDCs組)為細胞懸液1 mL和PBS 1 mL ,陽性對照(mDCs組)為細胞懸液1 mL和1mL含100 ng/mL脂多糖的完全培養基,放入37 ℃培養箱中繼續培養48 h。

1.2.5流式檢測DCs免疫表型分子的表達 收集共培養后的DCs,加入4%多聚甲醛固定10 min,用PBS洗滌2次,棄上清。加入相應抗體混勻后,室溫避光孵育20 min。孵育結束后,用流式細胞儀檢測DCs表面分子HLA-DR、CD11c、CD80、CD83、CD86及CCR7的表達情況。

1.2.6DCs遷移能力的檢測 收集共培養后的DCs,調整細胞密度為1×106個/mL。取24孔板,在Transwell下室加入完全培養基0.6 mL,上室加入0.2 mL細胞懸液,放入37 ℃, 5%CO2的培養箱中繼續培養24 h。遷移結束后,對遷移至下室的細胞進行計數并計算遷移率。

1.2.7蛋白印跡試驗(Western blot)檢測cGAS及STING蛋白表達 收集共培養后的DCs,提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度后,取50 μg總蛋白進行SDS-PAGE電泳,轉膜和封閉。TBST洗滌3次,加入GAPDH、cGAS及STING的特異性抗體,4 ℃孵育過夜,TBST洗滌3次后加入HRP標記的山羊抗兔IgG二抗,室溫孵育1 h,TBST洗滌3次,用ECL試劑盒檢測蛋白條帶。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 放療對NPC患者DCs亞群的影響

核磁共振影像顯示(圖1),放射治療前,NPC組患者腫瘤沿鼻咽壁凸向鼻咽腔,侵及周圍肌肉組織及骨質結構,核磁共振增強掃描顯示有明顯強化、信號不均。放射治療后,鼻咽黏膜稍增厚,腫瘤明顯退縮,增強后周圍組織強化減弱。外周血流式細胞檢測結果發現(表1、表2),與健康對照組相比,NPC患者外周血中MDCs和PDCs顯著減少(t=-4.041,t=-5.674;P<0.001);放射治療后,NPC患者外周血中MDCs的數量明顯減少(P<0.001),但PDCs的數量略有增加,但差異無統計學意義(P>0.05)。

表1 兩組被檢者血液中不同DCs亞群比例

表2 治療前與放療結束后NPC患者外周血中DCs亞群的數量變化

圖1 放療前后NPC患者鼻咽部腫瘤的核磁共振影像

2.2 大分割電離輻射照射后的NPC細胞促進imDCs成熟

結果發現(圖2),與imDCs組比較,imDCs+4 Gy組以及imDCs+18 Gy組中imDCs的免疫表型分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86及CCR7的表達顯著上調(P<0.001),表明imDCs向mDCs分化;Transwell實驗結果顯示(圖3),DCs遷移能力隨著電離輻射劑量的增加而增強(P<0.05)。

注：A、B分別為HLA-DR、CD11c、CD80、CD83、CD86及CCR7的流式細胞儀檢測結果及對應的統計結果;(1)與imDCs組比較,P<0.05;(2)與mDCs組比較,P<0.05;(3)與imDCs+4 Gy組比較,P<0.05。

注：(1)與imDCs組比較,P<0.05;(2)與imDCs+4 Gy組比較,P<0.05。

2.3 大分割電離輻射對NPC細胞與imDCs共培養后cGAS-STING信號通路的影響

Western blot的結果發現(圖4),與imDCs組相比,imDCs+4 Gy組和imDCs+18 Gy組能上調共培養的imDCs中cGAS和STING蛋白的表達水平(P<0.05)。

注：A、B分別為cGAS和STING蛋白的Western blot結果及對應的統計結果;(1)與imDCs組比較,P<0.05。

3 討論

NPC是由鼻咽粘膜內膜引起的上皮癌,具有較好的放療敏感性。放療后,非轉移性NPC患者的5年生存率可達到67%[13]。本研究發現,放療后NPC患者腫瘤明顯縮小,提示NPC患者對放療敏感,這與Sham等[14]的研究結果一致。現已知道,電離輻射不僅可以殺傷腫瘤細胞,還可以在一定條件下將免疫抑制的腫瘤微環境轉化為免疫原性腫瘤微環境[15],促進腫瘤抗原提呈和促進炎性細胞因子的分泌,啟動抗腫瘤免疫應答[11-12,16]。DCs作為一種特殊的抗原提呈細胞[4],在NPC治療中發揮著重要作用[8-10]。有研究表明,不同的DCs亞群和DCs浸潤數量與NPC患者的生存顯著相關[6-7]。DCs中cGAS-STING通路的激活可促進imDCs向mDCs分化[17]。本研究發現,與健康人相比,NPC患者血漿中MDCs和PDCs的數量顯著減少,說明NPC患者的免疫功能受到損害。放療后,NPC患者外周血中MDCs的數量減少,PDCs的數量略有增多,說明NPC患者的免疫系統正逐步恢復,放療可一定程度改善NPC患者的免疫抑制性腫瘤微環境。

有研究發現,電離輻射不僅能激活DCs中NF-κB信號通路,還能增強DCs的遷移以及對白細胞介素-12(IL-12)的分泌[3, 18],且大分割電離輻射照射后的DCs上調CD40、CD80、CD86及CCR7等免疫表型分子的表達[19]。本研究將imDCs與經大分割電離輻射照射的NPC細胞共培養,結果發現imDCs的免疫表型分子HLA-DR、CD80、CD83、CD86以及CCR7的表達顯著上調,且其遷移能力隨著電離輻射分割的增加而增強,表明imDCs向mDCs分化,可能有利于腫瘤抗原的提呈和特異性抗腫瘤免疫應答的啟動。

cGAS是細胞主要的DNA感受器,能夠識別病原體的雙鏈DNA后上調STING信號通路,誘導Ⅰ型干擾素的表達,啟動抗原特異性的T細胞應答[1, 5]。本研究發現,與imDCs組相比,與經18 Gy電離輻射照射后的NPC細胞共培養后,imDCs的cGAS和STING表達水平顯著上調,意味著cGAS-STING信號通路的啟動可能與大分割電離輻射破壞了更多的NPC細胞DNA結構有關。

綜上所述,大分割電離輻射放療除了能夠直接殺死NPC細胞外,還可通過cGAS-STING信號通路誘導imDCs向mDCs分化,進而啟動特異性的抗腫瘤免疫應答,這對深入理解NPC的臨床治療模式具有重要意義。