健脾化痰方改善小鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用*

王 瀟 嚴茂祥 何蓓暉 陳芝蕓

浙江中醫藥大學附屬第一醫院 浙江杭州 310006

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是代謝綜合征在肝臟的一種臨床表現，是單純性脂肪性肝炎發展至肝纖維化、肝硬化和肝癌的重要階段[1-3]。NASH 的發病機制雖未完全明確，但“二次打擊”學說現階段仍處于主導地位。NASH 現有的防治手段除了嚴格強化生活方式外，尚無其他明確有效的治療方法。近年來的研究發現，線粒體功能紊亂在NASH 的病理過程中起著重要作用，及時清除細胞內損傷的線粒體對于保護肝細胞具有重要作用。健脾化痰方由二陳湯和四苓散組成，我們的前期研究發現，健脾化痰方能夠糾正NASH 大鼠脂質代謝紊亂，減輕肝組織炎癥損傷，防止NASH 的進一步發展。本研究從調控自噬來探討健脾化痰方改善蛋氨酸-膽堿缺乏飲食（MCD）誘導的NASH小鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠40 只，體質量約20g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號：SYXK（浙）2018-0012；飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心。

1.2 健脾化痰方組成：陳皮、半夏、澤瀉各15g，茯苓、白術、豬苓各9g，炙甘草5g，生姜3g，烏梅1.5g，均為顆粒劑。

1.3 主要試劑和儀器：BCA 蛋白質定量試劑盒（biosharp）、總蛋白提取試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）；沉默信息調節蛋白（SIRT1）、p62、Beclin-1抗體（Immunoway 公司）；LC3 抗體（proteintech 公司）；數字病理切片掃描系統（ZEISS 公司）；生物樣品勻質器（precellys）；酶標儀（美國BioTek 公司）；凝膠成像儀（Bio-Rad 公司）。

1.4 實驗方法：40 只雄性C57BL/6J 小鼠隨機分為5組，正常組，MCD-NASH 模型組，健脾化痰方低、中、高劑量組，每組8 只。正常組普通飼料喂養，其余4 組喂養MCD 飼料，連續4 周。造模同時藥物干預組每天分別以11.76g/kg·d、23.29g/kg·d、46.58g/kg·d 的健脾化痰方灌胃，正常組和模型組以等體積生理鹽水灌胃。實驗結束前12h小鼠禁食，稱重，摘眼球放血法采血，全自動生物儀檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）含量；取肝臟組織，稱重后，部分肝組織冰凍切片油紅O 染色；部分甲醛固定，石蠟包埋，常規脫水透明，HE 和Masson 染色，數字病理切片掃描系統觀察肝組織病理變化并拍照。提取肝臟組織蛋白，免疫印跡法檢測肝組織中SIRT1、Beclin-1 和LC3 蛋白表達水平，ECL 化學發光凝膠成像系統拍照并分析。

1.5 統計學分析：采用SPSS 17.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩樣本均數間的比較采用t檢驗；多個樣本間的比較采用單因素方差分析（one way ANOVA），以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體質量及肝指數的變化：MCD飲食喂養4周后小鼠較正常組小鼠體質量明顯下降，肝指數與正常組相比明顯增加（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.0001）。健脾化痰方各組與模型組比較，體質量無統計學差異（P＞0.05），肝指數呈下降趨勢。見圖1。

圖1 小鼠體質量和肝指數情況

2.2 健脾化痰方對NASH 小鼠血清ALT 和AST 的影響：生物化學法檢測血清ALT和AST，結果顯示，模型組小鼠血清ALT和AST水平顯著升高（P＜0.0001）；健脾化痰方中和高劑量組ALT和AST含量與模型組比較明顯下降（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2。

圖2 健脾化痰方對NASH小鼠血清ALT和AST水平的影響

2.3 NASH 小鼠血清CHOL、TG、HDL-C 和LDL-C 含量：MCD飲食喂養小鼠4 周后，檢測發現血清CHOL、TG、HDL-C 和LDL-C 的水平與正常對照組小鼠無明顯差異，健脾化痰方干預各組也均無變化。見圖3。

圖3 小鼠血清中CHOL 、TG、HDL-C和LDL-C水平

2.4 健脾化痰方對小鼠肝臟組織病理的影響：與對照組相比，肝組織油紅O染色觀察到模型組小鼠肝組織內有大量的脂滴大泡，健脾化痰方能有效減少肝組織的脂肪沉積。HE染色和Masson染色結果顯示，模型組肝組織結構紊亂，出現不同程度的炎癥細胞浸潤和纖維化，而健脾化痰方能部分改善肝組織的病理改變。見圖4。

圖4 肝組織油紅O染色、HE染色和Masson染色（×200）

2.5 健脾化痰方對小鼠肝組織中自噬相關蛋白表達的影響：免疫印跡法檢測結果顯示，模型組肝組織中自噬活性正相關蛋白SIRT1、Beclin-1和LC3水平降低，負調控蛋白p62表達增高；健脾化痰方干預后SIRT1、Beclin-1和LC3蛋白表達上調，p62蛋白水平下降（P＜0.01，P＜0.001，P＜0.0001）。見圖5。

3 討論

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）在我國已成為僅次于病毒學肝炎的第二大肝臟疾病，嚴重危害人類健康，在年輕人中的發病率也逐年升高[4]。NASH 是NAFLD 疾病發生的初期階段，如果沒有得到有效的控制，約有20%的患者會發展為肝硬化[5，6]。因此，在疾病早期延緩或阻止其進一步發展至關重要，能有效改善NAFLD患者的生活質量及預后。

MCD 誘導的NASH 動物模型是目前研究NASH 的經典模型之一[7]。本研究結果通過MCD 建立的NASH 模型小鼠與正常組小鼠相比體質量明顯下降，肝指數顯著增高，而血清中TG、CHOL、LDL-C 和HDL-C 水平并沒有明顯差異，這與以往研究中NASH的造模結果一致。MCD誘導NASH 小鼠模型的原理與高脂飲食所致的NASH 不同，這是由于在MCD 誘導NASH 模型中膽堿的缺乏會造成肝內極低密度脂蛋白合成抑制，促使肝細胞內甘油三酯運出受阻，導致肝細胞內甘油三酯大量累積引起脂肪變性，進而激活脂質過氧化和氧化應激反應。而蛋氨酸缺乏損害細胞的氧化屏障，進一步加重肝臟脂肪變性和炎癥反應。因此，MCD 脂類代謝紊亂主要體現在肝臟，而不會出現NASH常見的全身性表現，如肥胖、血脂異常和胰島素抵抗等。

ALT 和AST 是肝細胞內非特異性的功能酶，在正常情況下人體血清中含量較低。當肝細胞受到炎癥反應素刺激時，細胞膜通透性增加，ALT和AST從細胞內釋放到血液中。因此，血清中ALT 和AST 的水平在一定程度上能夠反映肝細胞功能及其炎性損傷程度，通過其濃度變化可判斷疾病的進展、療效及預后等情況。本研究結果顯示，MCD 模型小鼠血清ALT 和AST 水平與正常組相比明顯升高，同時肝組織病理觀察到肝細胞中脂質沉積明顯增多，有大量炎癥細胞浸潤和部分纖維化。這也表明我們建立的動物模型能很好地模擬NASH在肝臟組織中的病理特征。

中醫學認為脾虛失運、濕化為痰、痰瘀郁熱，積損肝絡是NASH 發病的關鍵因素，脾虛痰濕是本病發生發展及預后的核心環節。通過健脾氣、化水濕、截痰濁、助消導、祛血瘀可以達到治療脂肪肝的目的[8-11]。健脾化痰方中的陳皮、半夏和茯苓可以健脾消痰；澤瀉、白術、豬苓具有健脾利濕、利水除濕之功效。諸藥配合，可健脾化痰而不傷正。本研究結果表明，健脾化痰方干預后NASH 小鼠肝指數下降，血清轉氨酶水平降低，肝組織脂肪變性、炎癥反應和纖維化均明顯減輕。

研究表明，NAFLD 患者肝細胞內自噬活性下降，肝臟損傷程度與其自噬受損程度密切相關[12]。SIRT1 是Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶（HDACs），能夠調節脂質代謝、減輕炎性反應和氧化應激損傷[13]。近來研究發現，細胞中SIRT1 過表達后，細胞自噬水平會增高。而敲除SIRT1 后，自噬水平顯著下降。同時相關研究也相繼證實，SIRT1 可通過去乙酰化作用對自噬相關蛋白功能發揮調控作用，在自噬的調節中起著關鍵性作用[14]。本研究結果進一步表明，健脾化痰方能上調NASH 小鼠肝細胞中SIRT1、Beclin-1 和LC3 蛋白水平，同時下調p62蛋白表達。因此，本研究結果提示，健脾化痰方可能是通過激活SIRT1，誘導自噬發生，保護肝細胞損傷，從而達到防治NASH的功效。