結締組織生長因子及吞噬和細胞運動蛋白1基因多態性與2型糖尿病腎病病位、病性的相關性研究

王全興，陳繼承，鄭曉軍 ，劉加河，紀春敏

（泉州市中醫院，福建 泉州 362000）

2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是以胰島素分泌相對不足及胰島素抵抗為特征的內分泌代謝性疾病［1］。由于血糖的控制不佳及遺傳易感性等因素影響，T2DM 容易引發心、腦、腎等大血管及微血管并發癥。糖尿病腎病（diabetic kidney disease，DKD）是以尿白蛋白排泄率增高及腎功能進行性下降為特征表現的腎小球硬化癥。2 型糖尿病腎病（type 2 diabetic kidney disease，T2DKD）是T2DM 最常見的微血管并發癥之一，在T2DM 患者中發病率高達25%～40%［2］。DKD 歸屬中醫學“消渴”“水腫”“腎消”“消渴腎病”等范疇［3］。研究發現DKD主要病位在腎、肝、脾，而病性為虛實夾雜［4］，臨床上T2DKD 不同病位和病性的演變趨勢、病理變化、臨床預后以及對藥物的敏感性均存在差異，這提示T2DKD 不同病位及病性的形成及變化趨勢等與先天因素存在密切聯系。全基因組關聯分析和相關薈萃分析已報道在不同人群中與DKD 易感性相關的一些基因［5］，其中吞噬和細胞運動蛋白1（engulfment and cell motility 1，ELMO1）基因的突變可引起細胞外間質代謝紊亂，導致細胞外基質的累積以及腎小管和腎小球基底膜增厚，從而增加DKD 的風險［6］。結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）在刺激系膜細胞增生、促進細胞外基質合成及促進腎臟纖維化等方面發揮作用［7］。課題組前期研究發現CTGF 基因rs2648875 位點及ELMO1 基因rs10951509 位點與T2DKD 的遺傳易感性相關［8］。因此，本研究進一步探討T2DKD 不同病位、病性形成與CTGF 基因rs2648875 位點及ELMO1基因rs10951509 位點多態性的關系，旨在初步探討T2DKD 不同病位、病性形成的遺傳學基礎。

1 臨床資料

1.1 西醫診斷標準 T2DM 診斷標準參照《中國2 型糖尿病防治指南（2017 年版）》［9］，DKD 診斷標準參照《糖尿病腎病防治專家共識（2014 年版）》［10］。

1.2 納入標準 ① 年齡30～70 歲；② 漢族，彼此間無血緣關系；③ 所有患者均簽署知情同意書。

1.3 排除標準 ① 合并有高血糖高滲狀態、糖尿病酮癥酸中毒等急性并發癥者；② 合并有嚴重心、肝等臟器并發癥者；③ 因泌尿系感染、發熱、運動等因素導致的ACR 升高者；④ 無持續蛋白尿而出現腎功能迅速惡化者；⑤ 原發性腎小球疾病、高血壓病、心功能不全、血液病、自身免疫性疾病、腫瘤及藥物等導致的繼發性腎損害者；⑥ 精神疾病患者。

1.4 一般資料 選取2017 年1 月—2018 年6 月于泉州市中醫院內分泌科住院及門診就診的T2DKD患者195 例作為T2DKD 組，同時選取泉州市中醫院體檢中心體檢的健康人群134 例作為對照組，健康人群無糖尿病、DKD、腎損害、高血壓病、冠心病等病史。T2DKD 組男114 例，女81 例；年齡（57.01±9.19）歲。對照組男87 例，女47 例；年齡（55.72±10.89）歲。2組性別、年齡比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究通過泉州市中醫院醫學倫理委員會審核通過，批件號：〔2016〕泉中醫倫理審字第（001）號。

2 研究方法

2.1 中醫證素的提取 參照《中醫主癥鑒別診療學》［11］，以“600 常見癥狀的辨證意義”為依據，制訂規范化四診信息采集量表，包括始因、寒熱、汗出、疼痛、頭身不適、咳痰喘、飲食口味、睡眠情志、二便、出血、經帶精液、神志面色、全身體征及舌脈等600 個常見癥狀，進行四診資料的規范化采集。參照朱文鋒《證素辨證學》［12］，根據四診信息在診斷中的權重，以加權閾值法確定證素。證素積分之和＜70 分，歸為0 級（基本無該證素病理變化）；70 分≤證素積分之和＜100 分，歸為1 級（輕度病理變化）；100 分≤證素積分之和＜150 分，歸為2 級（明顯病理變化）；證素積分之和≥150 分，歸為3 級（嚴重病理變化）。本研究以100 分作為通用閾值，各癥狀對某一證素貢獻度之和達到100 分時，即可診斷為該證素；而未達到100 分時，則歸為非該證素。該研究中四診信息錄入和證素積分計算分析通過福建中醫藥大學中醫證研究基地開發的“中醫健康狀態辨識與咨詢系統V1.0”完成。

2.2 基因組DNA 的提取 采集2 組患者空腹外周靜脈血3 mL，采用中量全血基因組DNA 提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司，批號：DP2102）進行基因組DNA 的提取。應用Nanodrop-2000 型超微量紫外分光光度計（美國Thermo 公司）檢測基因組DNA純度和濃度，最終DNA的濃度約為20 ng/μL，A260/A280在1.8 左右，所有基因組DNA 樣本的純度和濃度均達到實驗要求。

2.3 CTGF 及ELMO1 基因多態性分析 采用上海天昊生物科技有限公司自主專利研發的imLDRTM多重SNP 分型試劑盒進行多態性檢測。具體實驗原理及過程：① ELMO1 基因rs10951509 位點及CTGF基因rs2648875 位點所在區段先采用多重PCR 反應在一個體系中獲得擴增。② 擴增產物經外切核酸酶/蝦堿酶（ExoI/SAP）純化，用于后續連接酶反應的模板。③ 將擴增產物與ELMO1 基因rs10951509位點及CTGF 基因rs2648875 位點特異性探針進行連接反應。在一個連接反應中，每個位點包含2 個5'端等位基因特異探針以及緊挨其后的一條3'端位點的熒光標記的特異探針。④ 通過3730XL 型測序儀（美國ABI 公司）進行毛細管電泳區分連接產物的熒光標記及長度信息。⑤ 用GeneMapper 4.1軟件分析CTGF 基因rs2648875 位點和ELMO1 基因rs10951509 位點的AA、GA、GG 基因型分布情況。

2.4 統計學方法 采用SPSS 23.0 軟件進行數據分析。計數資料比較采用χ2檢驗。ELMO1 基因及CTGF 基因各基因型與病位、病性的相關性分析采用無序多分類logistic 回歸分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 T2DKD 患者病位、病性證素分布情況 篩選頻率＞10%的證素，T2DKD 患者病位證素前3 位依次為腎、肝、脾，主要實證病性證素依次為濕、熱、痰，主要虛證病性證素依次為陰虛、氣虛、血虛、陽虛。見表1、表2。

表1 T2DKD 患者病位證素分布情況

表2 T2DKD 患者病性證素分布情況

3.2 CTGF 基因rs2648875 多態性分析 2 組AA、GA 及GG 基因型分布比較，差異有統計學意義（χ2＝8.639，P＝0.013），見表3。

3.3 CTGF 基因rs2648875 基因型與病位、病性相關性分析 CTGF 基因rs2648875 基因型AA、GA、GG 的分布在T2DKD 病位證素腎、肝、脾、胃、經絡和病性證素濕、熱、痰、氣滯、陽亢、陰虛、氣虛、血虛、陽虛上比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。以GG 基因型作為參照，與非血瘀比較，攜帶CTGF 基因AA 基因型的血瘀患者是其0.190 倍（P＜0.01），攜帶CTGF 基因GA 基因型的血瘀患者是其0.185倍（P＜0.01），見表4、表5。

表4 CTGF 基因rs2648875 位點基因型與病位證素相關性分析

表5 CTGF 基因rs2648875 位點基因型與病性證素相關性分析

3.4 ELMO1基因rs10951509多態性分析 2組AA、GA、GG 基因型分布比較，差異有統計學意義（χ2＝6.770，P＝0.034），見表6。

表6 2 組ELMO1 基因rs10951509 位點基因型分布比較［n（%）］

3.5 ELMO1 基因rs10951509 基因型與病位、病性相關性分析 ELMO1 基因rs10951509 基因型AA、GA、GG 的分布在T2DKD 病位證素腎、肝、脾、胃、經絡和病性證素濕、熱、痰、氣滯、血瘀、陽亢、陰虛、氣虛、血虛上比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。以GG 基因型作為參照，與非陽虛比較，攜帶ELMO1 基因AA 基因型的陽虛患者是其8.831 倍（P＜0.05），攜帶ELMO1 基因GA 基因型的陽虛患者是其9.022 倍（P＜0.05），見表7、表8。

表7 ELMO1 基因rs10951509 位點基因型與病位證素相關性分析

表8 ELMO1 基因rs10951509 位點基因型與病性證素相關性分析

4 討 論

《古今錄驗方》有云：“消渴，病有三……渴而飲水不能多，小便數，陰痿弱，但腿腫，腳先瘦小，此腎消病也。”提出消渴出現以小便數、水腫為主要表現的“腎消”概念。北宋趙佶在《圣濟總錄》載：“消腎，小便白濁如凝脂，形體羸瘦”，首次提出了“消腎”的概念。呂仁和教授將消渴分為3 期：脾癉、消渴及消癉，并將DKD 稱之為消渴病腎病，認為其屬于消癉期［13］。DKD 病因病機復雜，中醫各家對其均有獨到見解。江旭鋒等［14］總結DKD 的病因為稟賦不足、六淫邪毒、飲食失宜、勞欲過度、情志失調、藥物誤用。扈麗萍［15］總結DKD 病機之根本為正虛，而邪實次之，表現為虛實并存，寒熱相兼；其中本虛以腎脾氣虛為主，實則為邪熱濁毒、瘀血、痰濁、痰瘀同存。仝小林等［16］則認為，腎虛、痰濁、血瘀是DKD 的基本病機。

《糖尿病腎病中醫防治指南》［17］也指出：DKD為素體腎虛，消渴遷延日久，耗氣傷陰，五臟受損，同時兼夾痰、瘀、熱、郁等。本研究采用證素辨證法分析發現，T2DKD 患者主要病位證素依次為腎、肝、脾；主要實證病性證素依次為濕、熱、痰，主要虛證病性證素依次為陰虛、氣虛、血虛、陽虛。

西醫學認為DKD 是環境因素與遺傳因素共同作用的結果，其中遺傳因素是決定DKD 易感性及嚴重程度的重要因素。中醫病因學包括外感六淫、飲食、勞倦、七情等因素，而體質因素在疾病過程中也起著重要作用。《黃帝內經》云：“腎脆則善病消癉易傷。”提示消渴何臟不足，就容易引起何臟并發癥。腎臟脆弱則容易并發DKD，提示糖尿病并發癥的發生與體質存在相關性。證是機體內在因素與環境外因綜合作用的反應狀態，其中體質是證形成的基礎，決定了不同證形成的易感性，而遺傳多態性則是影響不同體質形成的重要因素之一［18］。因此，有學者認為遺傳多態性是疾病不同證形成的內在因素之一。課題組前期研究發現，T2DKD 不同病位、病性的形成與糖脂代謝紊亂、尿酸排泄障礙及腎功能下降有一定相關性［8］。林蘭等［19］研究表明，早期DKD 患者的不同證候形成與亞甲基四氫葉酸還原酶基因677 堿基多態性具有相關性。可見DKD 不同證的形成與遺傳多態性存在相關性。

人CTGF基因位于染色體6q23.1上，其含有4個內含子和5 個外顯子，其中5 個外顯子分別編碼4 個功能片段及CTGF 的分泌信號肽。CTGF 蛋白在腎臟中表達最高，為轉化生長因子β 的下游效應因子，其通過刺激腎小球系膜細胞增生，促進細胞外基質合成堆積，導致腎小球硬化，最終發生腎臟纖維化。CTGF 參與DKD 的整個病理過程［7，20］。MASON［21］研究發現，CTGF 基因rs9399005 位點多態性可改變患者血清水平，CTGF 在腎纖維化過程中發揮多種生物學活性。課題前期研究發現，CTGF 基因rs2648875 位點A 等位基因為T2DKD 的易感基因。本研究結果顯示，T2DKD 血瘀患者CTGF 基因AA 基因型風險為非血瘀患者的0.190 倍（P＜0.01），CTGF 基因GA 基因型風險為非血瘀患者的0.185 倍（P＜0.01），推測T2DKD 血瘀證的形成與CTGF 基因rs2648875 位點GG 基因型相關，攜帶GG 基因型患者更容易兼夾血瘀。

人ELMO1 基因位于染色體7p14.2 上，其包含22 個外顯子及21 個內含子。ELMO1 蛋白的過表達可導致細胞外基質沉積，細胞黏附性降低，引起腎小球和腎小管基底膜增厚，尿蛋白排除增多，最終引起腎小球和腎小管損傷［6］。HANSON 等［22］研究發現，亞利桑那州的印第安人DKD 的發生與攜帶ELMO1基因rs10951509位點A等位基因和rs1345365位點A等位基因具有明顯關聯性。對我國漢族人群的研究發現，攜帶ELMO1 基因rs741301 位點G 等位基因和rs10255208 位點GG 基因型患DKD 風險顯著增加［23］。BAYOUMY 等［24］研究發現，埃及人群中ELMO1 基因rs741301 位點G 等位基因與T2DKD 的發生具有明顯關聯性。課題組前期研究發現，ELMO1 基因rs10951509 位點A 等位基因為DKD 的易感基因。本研究結果顯示，T2DKD 陽虛患者ELMO1 基因AA 基因型風險為非陽虛患者的8.831 倍（P＜0.05），ELMO1 基因GA 基因型風險為非陽虛患者的9.022 倍（P＜0.05）。推測T2DKD 陽虛證的形成與ELMO1 基因rs10951509 位點A 等位基因相關，攜帶AA 和GA 基因型患者更容易兼夾陽虛。

綜上所述，T2DKD 主要病位為腎、肝、脾，主要實證病性證素依次為濕、熱、痰，主要虛證病性證素依次為陰虛、氣虛、血虛、陽虛。T2DKD 不同證的形成與遺傳因素存在密切關系。證的形成是一個復雜的病理過程，本研究僅從遺傳多態性角度發現T2DKD 不同證的形成與先天因素具有相關性。后續進一步深入開展相關基因組學、蛋白組學等研究，將有助于進一步深入揭示證形成的病理本質。