基于PERK-eIF2α通路探討蓯蓉舒痙顆粒對帕金森病模型大鼠黑質紋狀體內質網應激的調節作用

陳乃潔，林 瑤，許 茜，袁明洲，林如輝，李茜羽，陳詩雅，蔡 晶*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；2.福建中醫藥大學科技創新與轉化中心，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學附屬第三人民醫院，福建 福州 350108）

帕金森病（Parkinson's disease，PD）為全球第二大神經退行性疾病，隨著我國人口老齡化的加劇，發病率逐年上升，預計2030 年中國PD 患者將增至494 萬，占全球PD 患者的一半［1］。PD 運動癥狀表現為運動遲緩、靜止性震顫、肌強直等，非運動癥狀包括嗅覺減退、認知功能障礙、睡眠障礙等，給社會帶來極大的疾病負擔，目前的藥物治療以改善癥狀為主，隨著病程進展，藥效下降和并發癥等問題往往隨之出現［2-3］。因此，探索中藥治療PD 的療效及機制，可為PD 的治療提供新的思路。

PD 主要病理特點為黑質神經細胞的丟失及α-突觸核蛋白（α-synuclein，α-syn）積聚所致路易小體的形成，具體發病機制可能與內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）蛋白激酶樣內質網激酶（protein kinase-like ER kinase，PERK）-真核翻譯起始因子2α（eukaryotic translation initiation factor 2 alpha，eIF2α）通路有關［4］。補腎益髓活血復方蓯蓉舒痙顆粒源于地黃飲子，為課題組基于臨床實踐并經過藥物篩選、動物實驗等驗證的經驗方，可有效降低黑質α-syn 水平，抑制黑質神經細胞的凋亡，改善PD 大鼠模型的行為學異常［5］，但其療效機制是否與PERK-eIF2α 通路相關，尚不明確。本研究擬觀察蓯蓉舒痙顆粒對PD 模型大鼠黑質紋狀體PERK-eIF2α 通路的動態影響，以探索蓯蓉舒痙顆粒治療PD 的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF 級成年健康雄性SD 大鼠100只，體質量180～220 g，購自杭州醫學院，實驗動物生產許可證號：SCXK（浙）2019-0002，飼養于福建中醫藥大學動物實驗中心SPF 級動物實驗室，許可證：SYXK（閩）2019-0007，溫度20～22 ℃，相對濕度60%～65%，光照/黑暗周期為12 h，飲水攝食自由。本實驗經福建中醫藥大學動物倫理中心審核通過（2019039）。

1.2 實驗藥物 取魚藤酮粉末150 mg 加入葵花油100 mL 中，制備濃度為1.5 mg/mL 的魚藤酮葵花油乳液。蓯蓉舒痙顆粒由肉蓯蓉6 g，制黃精12 g，丹參15 g，赤芍12 g，牡丹皮10 g 組成，購自福建中醫藥大學附屬第三人民醫院。取20 g 蓯蓉舒痙顆粒加入100 mL 蒸餾水配制濃度為200 mg/mL 的蓯蓉舒痙顆粒藥液。以上藥物制備后均置于4 ℃低溫避光保存。

1.3 實驗試劑 魚藤酮、葵花油均購自美國Sigma公司（批號：R8875、S5007）；20%烏拉坦（國藥集團化學試劑有限公司，批號：30191228）；PERK 抗體、p-eIF2α 抗體均購自武漢賽維爾生物科技有限公司（批號：GB13449、GB13572）；p-PERK 抗體、eIF2α抗體均購自美國Immunoway 公司（批號：YP1055、YT1507）；電鏡固定液（武漢谷歌生物科技有限公司，批號：G1102）。

1.4 實驗儀器 透射電鏡（日本Hitachi 公司）；Eclipse Ci-L 正置白光拍照顯微鏡（日本Nikon 公司）；石蠟包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；石蠟切片機（上海徠卡儀器有限公司）；Image-Pro Plus 6.0分析系統（美國Media Cybemetics 公司）；酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；全自動數碼凝膠圖像分析系統（上海天能科技有限公司）；串聯質譜儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與干預 將100 只SPF 級成年健康雄性SD 大鼠根據SPSS 24.0 軟件隨機分為正常組33 只和造模組67 只，造模組大鼠按1 mL/（kg·d）予頸背部皮下注射魚藤酮葵花油乳液建立PD 模型，每日1 次，連續注射2 周，隔周休息1 d［6］。造模結束后，參照陳忻等［7］制定的行為學評分標準進行評定，評分2～8 分者為造模成功。將造模成功的大鼠隨機分為模型組34 只和治療組33 只。參照《醫學實驗動物學》［8］中的人與動物用藥量換算公式，按人的臨床常用劑量的6.3 倍換算，治療組予蓯蓉舒痙顆粒藥液6.8 mL/（kg·d）灌胃，正常組和模型組予以等體積生理鹽水灌胃，每日1 次，連續14 d。

2.2 平行反應監測（PRM）檢測大鼠黑質紋狀體eIF2α 特異性肽段變化趨勢 3 組分別于灌胃第1、3、5、7、9、11、13、14 天各取3 只大鼠腹腔注射20%烏拉坦（0.5 mL/100 g）麻醉，快速斷頭取腦，冰上分離黑質紋狀體，置-80 ℃冰箱保存待用。從樣品中提取蛋白，用BCA 法測定蛋白質濃度，采用SDSPAGE 電泳分析評價樣品質量是否符合后續實驗要求，對質量達標的蛋白樣品進行還原烷基化處理。每個樣品取等量蛋白進行胰蛋白酶酶解純化，分別上機進行液相串聯質譜PRM 檢測，采用該物種Uniprot 蛋白數據庫作為背景庫，篩選特異性肽段，采用Skyline 對PRM 原始數據進行定量分析。

2.3 透射電鏡觀察大鼠黑質神經細胞超微結構 灌胃14 d 后3 組各取3 只大鼠腹腔注射20%烏拉坦（0.5 mL/100 g）麻醉，快速斷頭取腦。在冰浴中切取黑質，用含2.5%戊二醛的電鏡固定液快速固定過夜，并于4 ℃下用1%鋨酸固定2 h，梯度乙醇脫水，包埋，切成60 nm 超薄切片，用醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，置于透射電鏡下觀察大鼠中腦黑質神經細胞超微結構的變化并攝影記錄。

2.4 免疫組化檢測大鼠黑質PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α 的表達 灌胃14 d 后3 組各取3 只大鼠，0.5 mL/100 g 腹腔注射20%烏拉坦麻醉，打開胸腔，向左心室灌注生理鹽水（4 ℃）沖洗血液至肝臟變白，待右心房流出的液體變清亮時，灌注4%多聚甲醛溶液，灌注完成后仔細分離取腦組織。常規固定、脫水、透明、浸蠟、包埋處理，將石蠟包埋好的各組大鼠組織連續冠狀切片，切片厚度5 μm，載玻片附貼組織切片，置于4 ℃冰箱保存備用。石蠟切片常規脫蠟復水，枸櫞酸鹽修復完成后，經通透、封閉，加入PERK（1∶100）、p-PERK（1∶200）、eIF2α（1∶200）、p-eIF2α（1∶500）一抗孵育，后經辣根過氧化酶標記二抗染色、DAB 顯色試劑盒顯色、蘇木素復染、PBS 返藍、梯度酒精脫水及中性樹膠封片等步驟，于Eclipse Ci-L 拍照顯微鏡下選取黑質區域采集圖像，使用Image-Pro Plus 6.0 分析軟件，以棕色顆粒染色為陽性表達，分別測量每張切片中3 個視野陽性表達細胞的累積光密度值（A值）以及對應的組織像素面積（Area），并計算平均光密度值。

2.5 統計學方法 采用SPSS 24.0 軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，組內不同時間點比較采用重復測量方差分析；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時采用LSD-t法，方差不齊時采用Game's-Howell 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 3 組大鼠黑質紋狀體不同時間點eIF2α 特異性肽段變化趨勢 與正常組比較，模型組在灌胃第1～7 天總體趨勢較低，但差異無統計學意義（P均＞0.05），第13、14 天均明顯增高（P均＜0.05）；與模型組比較，治療組在灌胃第5 天明顯增高（P＜0.01），第13、14 天時均明顯減低（P均＜0.05）。見表1。

表1 3 組大鼠黑質紋狀體不同時間點eIF2α 特異性肽段定量比較（±s） ×106

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.01，3） P＜0.05。

第14天6.14±0.35 6.98±0.361）6.22±0.313）組別正常組模型組治療組n3 3 3第1天6.37±0.47 5.98±0.50 6.43±0.49第3天6.19±0.44 6.10±0.46 6.54±0.37第5天6.24±0.45 5.56±0.32 6.90±0.382）第7天6.32±0.37 5.95±0.42 6.65±0.38第9天6.34±0.36 6.48±0.30 6.10±0.42第11天6.30±0.45 6.87±0.33 6.17±0.46第13天6.21±0.49 7.09±0.351）6.28±0.373）

3.2 3 組大鼠黑質神經細胞超微結構觀察 透射電鏡顯示，正常組大鼠黑質神經細胞形態正常，胞質內可見形態正常的內質網，隱約可見核糖體附著；模型組大鼠黑質神經細胞腫脹，內質網明顯擴張、斷裂，呈小空泡樣改變；治療組大鼠黑質神經細胞腫脹減輕，內質網擴張等形態異常有所改善。見圖1。

圖1 3 組大鼠黑質神經細胞透射電鏡圖（×2 000）

3.3 3 組大鼠黑質PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α表達比較 免疫組化顯示目標蛋白染色呈棕色，定位于胞漿中。與正常組比較，模型組PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α 的平均光密度值明顯增高（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，治療組PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α 的平均光密度值明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖2、表2。

圖2 3 組黑質PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α 免疫組化圖（×400）

表2 3 組大鼠黑質PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α 平均光密度值比較（±s） ×10-3

表2 3 組大鼠黑質PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α 平均光密度值比較（±s） ×10-3

注：與正常組比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與模型組比較，3） P＜0.05，4） P＜0.01。

p-eIF2α 0.07±0.05 0.28±0.112）0.10±0.053）組別正常組模型組治療組n3 3 3 PERK 7.24±2.32 13.89±1.591）9.45±1.023）p-PERK 4.26±1.60 13.05±2.341）4.16±2.034）eIF2α 16.76±1.83 24.00±2.142）16.92±3.653）

4 討 論

PD 屬于中醫學“顫證”范疇，其病位在腦，著于筋脈，病機屬本虛標實，腎虛為本，血瘀為標。腎精虧虛，精氣不能上承，以致瘀血內生，腦竅、筋脈失養，從而出現運動遲緩、震顫不能自止等臨床表現。因此，治法需以“補腎益髓活血”為主［9-10］。蓯蓉舒痙方以肉蓯蓉為君藥，補腎壯陽，填精補髓；以制黃精為臣藥，健脾益腎，補氣養陰；以丹參、赤芍、牡丹皮為佐藥，清熱涼血，活血祛瘀。諸藥合用，標本同治，使腎虛得補，瘀血得化，則腦髓得充，筋脈得養，震顫得除［11-12］。

ERS 是真核細胞的一種自我防御機制。在缺氧、毒物等刺激或疾病狀態下，內質網功能障礙，大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質堆積于內質網，可引發未折疊蛋白反應（UPR）以提高細胞的適應性，使內質網重新達到穩態，但持續而過度的ERS 則可誘發細胞凋亡、自噬［13-14］。研究發現，A53T 突變α-syn過表達的PC12 細胞可呈現時間依賴性的ERS 活化，并由于持續過強的ERS 誘發ERS 依賴的細胞程序性死亡；但在必須啟動細胞凋亡之前，ERS 未折疊蛋白反應是抑制細胞損傷的最終保護途徑［15］。PERK-eIF2α 通路為UPR 信號通路之一，ERS 狀態下，PERK 被激活發生磷酸化反應，p-PERK 使其下游eIF2α 活化并磷酸化，根據PERK-eIF2α 通路激活的動態變化，可兼具促適應或促凋亡的作用［16］。PD 患者死后活檢顯示，黑質多巴胺能神經元p-PERK 和p-eIF2α 的表達顯著增加［17］；在1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）或6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導的PD 鼠類模型及各類PD 相關轉基因動物模型中，均可檢測到PERK-eIF2α 通路相關蛋白的活化［18-20］，提示PERK-eIF2α 通路激活在PD 發病機制中的促凋亡作用。但亦有研究發現，敲除了PERK 的神經元更易受6-OHDA 的損傷；peIF2α 水平增高可延緩表達家族性PD 相關突變體A53T 人α-syn 的轉基因小鼠模型的發病，并減輕α-syn 的聚集，提示PERK-eIF2α 通路的適度激活可促神經元適應，對多巴胺能神經元可能具有一定的保護作用［21-22］。

本研究通過PRM 蛋白相對定量分析檢測eIF2α的特異性肽段的動態表達，從大致的變化趨勢中可見，在灌胃前7 d 模型組黑質紋狀體eIF2α 總體趨勢較低，第13、14 天時明顯增高，且灌胃14 d 后通過透射電鏡觀察發現模型組大鼠黑質神經細胞內質網形態紊亂，PERK-eIF2α通路蛋白表達增高。提示在PD 造模下，隨著魚藤酮毒性的累積，內質網應激PERK-eIF2α 通路活性緩慢升高，后持續維持于較高水平，而持續過強的內質網應激則可導致相關細胞凋亡。與模型組比較，經蓯蓉舒痙顆粒干預后，eIF2α 于干預第5 天明顯提高，第13、14 天時明顯減少，且透射電鏡顯示干預14 d 后治療組大鼠黑質神經細胞內質網形態明顯改善，免疫組化顯示治療組PERK-eIF2α 通路蛋白表達明顯降低。提示蓯蓉舒痙顆粒在治療早期可短暫提高內質網應激PERK-eIF2α 通路活性，從而增強內質網蛋白折疊能力及內質網相關蛋白降解，提高細胞適應性，促進細胞存活，減輕造模藥物的毒副作用；治療中后期，藥物作用導致內質網應激PERK-eIF2α 通路活性降低，避免持續過強的內質網應激引起的負面作用，以恢復內質網穩態，從而起到動態的神經保護作用。

綜上所述，蓯蓉舒痙顆?？烧{節內質網應激PERK-eIF2α 通路，從而恢復內質網穩態，起到神經保護的作用。后續研究擬進一步增加樣本量，選取更多時間節點檢測分析，完善治療期間和后續療效評估，繼續深入探究蓯蓉舒痙顆粒的療效及機制。