芪靈扶正清解方對Huh-7細胞能量代謝及糖酵解相關蛋白的影響

顏 碩，劉海琴，郭康悅，何家珺，曹治云，章尤權，林明和，陳旭征*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122；4.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；5.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003）

肝細胞性肝癌是臨床上常見的消化系統惡性腫瘤之一。據世界衛生組織國際癌癥研究機構（International Agency for Research on Cancer，IARC）發布的2020 年全球最新癌癥負擔數據顯示，在全球發病率與病死率中肝細胞性肝癌分別居第6 位與第3 位［1］，肝細胞性肝癌已成為我國高發疾病之一。該病起病隱匿、腫瘤生長迅速、高復發轉移率與多藥耐藥是肝癌患者生存率較低的主要因素，目前仍無理想的治療藥物。芪靈扶正清解方（Qiling Fuzheng Qingjie formula，QFQ）為福建中醫藥大學附屬第二人民醫院杜建教授經驗方和院內制劑，是消化道腫瘤患者圍手術期和圍放化療期的輔助用藥，能多方面調理患者基礎治療后導致的體質虛弱，提升抗御外邪之力，具有抑制肝癌細胞生長的作用［2］，然而其抑制肝癌細胞生長的作用機制仍未明確。近年研究發現，肝癌細胞不管是否處于缺氧環境，其細胞內高活性的糖酵解是肝癌細胞增殖期間所需能量的主要來源［3］，抑制肝癌細胞糖酵解成為篩選抗癌藥物的新途徑。因此，本研究基于與肝癌細胞密切相關的糖酵解途徑，探討QFQ 對肝癌細胞能量代謝及糖酵解相關蛋白的影響，進一步闡明QFQ抑制腫瘤細胞生長的機制。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 Huh-7 細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 實驗試劑 Seahorse XF 細胞糖酵解速率測定試劑盒、實時ATP 速率試劑盒均購自中國安捷倫科技有限公司（貨號：103344-100、103592-100）；缺氧誘導因子1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、己糖激酶（hexokinase，HK）、葡萄糖轉運蛋白（glucose transporter，Glut）1、Glut3、GAPDH 等一抗及二抗均購自武漢三鷹生物技術有限公司（貨號：66730-1-Ig、15656-1-AP、21829-1-AP、20403-1-AP、60004-1-Ig）；CCK8 試劑（大連美侖生物技術有限公司，貨號：MA0218）；胎牛血清、高糖DMEM 培養基和胰蛋白酶均購自美國Gibco 公司（貨號：10100147、11965092）；青-鏈霉素（美國Hyclone 公司，貨號：SV30010）。

1.3 實驗儀器 Seahorse XFe 96 細胞能量代謝分析儀（中國安捷倫科技有限公司）；CO2培養箱、多功能酶標儀均購自美國Thermo 公司；化學成像分析系統（廣州博鷺騰生物科技有限公司）；電泳儀和電泳槽（美國Bio-Rad 公司）。

2 實驗方法

2.1 QFQ 醇提取物制備 QFQ 由黃芪30 g，女貞子15 g，靈芝30 g，山藥15 g，白花蛇舌草30 g，夏枯草15 g 組成。準備15 劑QFQ，粉碎后稱重，置于75%乙醇中浸泡2 h。第1 次在1∶3 料液比下置于85 ℃水浴鍋回流提取1 h，收集濾液；第2 次在1∶2 藥液比下以相同方法進行提取并收集濾液。合并2 次濾液，置于旋轉蒸發儀上，于60 ℃、30 r/min 下旋蒸除去多余溶劑，揮干，置于-20 ℃冰箱儲存備用。

2.2 細胞培養 將Huh-7 細胞培養于DMEM 高糖培養基中，置于37 ℃、含5 % CO2培養箱，待細胞長至對數期，開展后續實驗。

2.3 CCK8 法檢測細胞活力 將細胞接種于96 孔板，加入0、62.5、125、250、500 μg/mL QFQ 醇提物，分別干預24、48、72 h 后，每孔中加入10 μL CCK8溶液繼續在培養箱孵育2 h，在多功能酶標儀490 nm波長處測量各孔吸光度（A值），計算細胞活力。

2.4 細胞能量代謝相關指標檢測 將Huh-7 細胞懸液以5 000個/孔接種在XF96細胞培養板中，背景校正孔不接種細胞，靜置1 h 后放入37 ℃的CO2培養箱中過夜培養，分別給予0、62.5、125、250 μg/mL QFQ 醇提物干預24 h，同時水化探針板，配置Seahorse 海馬檢測液，應用細胞能量代謝分析儀，根據實時ATP 速率試劑盒說明書檢測線粒體ATP 產生速率、糖酵解ATP 產生速率、實時耗氧率、胞外酸化率，根據細胞糖酵解速率測定試劑盒說明書檢測糖酵解速率、質子流出速率，采用Wave 2.6.1 軟件分析數據。

2.5 Western blot 檢 測Huh-7 細 胞HIF-1α、HK、Glut1 和Glut3 蛋白表達量 按1×105個/mL 密度將Huh-7 細胞接種于10 cm 培養皿中，當細胞培養生長至60%～70%時，將Huh-7 細胞分為0、62.5、125、250、500 μg/mL 組，分別予相應濃度的QFQ 醇提物干預24 h。裂解細胞后提取總蛋白，經過蛋白變性、電泳、轉膜后，5 %脫脂奶粉室溫搖床封閉1 h，TBST洗滌后置于HIF-1α（1∶2 000）、HK（1∶1 000）、Glut1（1∶1 000）、Glut3（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）一抗中4 ℃孵育過夜，經TBST 洗滌后置于二抗溶液（1∶10 000）中，室溫下搖床孵育1 h，TBST 洗滌3 遍（每遍10 min），ECL 顯影觀察并進行條帶的檢測和分析，以目的蛋白條帶與內參條帶灰度值比值作為目的蛋白表達量。

2.6 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；重復測量資料采用單因素重復測量方差分析。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 5組Huh-7細胞活力比較 125、250、500 μg/mL QFQ 醇提物分別干預Huh-7 細胞24、48 和72 h 之后，Huh-7細胞活力被明顯抑制（P＜0.01）。見圖1。

圖1 5 組Huh-7 細胞活力比較

3.2 4 組Huh-7 細胞ATP 產生速率比值比較 與0 μg/mL 組比較，62.5、125、250 μg/mL 組Huh-7 細胞線粒體和糖酵解ATP 產生速率比值明顯提高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 4 組Huh-7 細胞ATP 產生速率比值比較

3.3 4 組Huh-7 細胞實時耗氧率比較 與0 μg/mL組比較，隨著檢測時間延長，62.5 μg/mL 組Huh-7細胞實時耗氧率呈升高趨勢（P＜0.05）。見圖3。

3.4 4 組Huh-7 細胞胞外酸化率比較 與0 μg/mL組比較，隨著檢測時間延長，250 μg/mL 組Huh-7細胞胞外酸化率呈降低趨勢（P＜0.05）。見圖4。

圖4 4 組Huh-7 細胞胞外酸化率比較

3.5 4 組Huh-7 細胞糖酵解速率比較 與0 μg/mL組比較，125、250 μg/mL 組Huh-7 細胞糖酵解速率明顯降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖5。

圖5 4 組Huh-7 細胞糖酵解速率比較

3.6 4組Huh-7細胞質子流出速率比較 與0 μg/mL組比較，隨著檢測時間變化，250 μg/mL 組的質子流出速率呈降低趨勢（P＜0.05）。見圖6。

圖6 4 組Huh-7 細胞質子流出速率比較

3.7 5 組Huh-7 細胞Glut1、Glut3、HK 和HIF-1α 蛋白表達量比較 與0 μg/mL 組比較，62.5、125、250、500 μg/mL 組Huh-7 細 胞 的HIF-1α、HK、Glut1、Glut3 蛋白表達量均明顯降低（P＜0.01 或P＜0.05）。見圖7、圖8。

圖7 5組Huh-7細胞Glut1、Glut3、HK和HIF-1α蛋白條帶圖

圖8 5 組Huh-7 細胞Glut1、Glut3、HK和HIF-1α 蛋白表達量比較

4 討 論

中醫學認為肝癌的病因可分為內因、外因，內因主要為正氣不足，外因則是邪毒（多為疫癘之毒、酒毒、藥毒、食毒等）內侵，病機主要責之于氣陰兩虛、熱毒內盛［4］。QFQ 中黃芪、女貞子為君藥，益氣養陰；靈芝、山藥為臣藥，扶正培本；白花蛇舌草、夏枯草合為佐使，清熱解毒、消癰散結。諸藥共奏清熱解毒、益氣養陰之功，標本兼顧，攻補兼施。前期研究顯示，QFQ 可通過線粒體凋亡通路抑制腫瘤細胞增殖，誘導細胞凋亡，增強細胞免疫功能［2］，對輔助抗癌具有深遠的價值。

低氧是腫瘤組織環境中一個主要特征，低氧調節著腫瘤的發生與發展［5］。腫瘤細胞為了抵抗低氧，代謝途徑由氧化磷酸化轉變成無氧糖酵解途徑，導致線粒體ATP 產生速率降低，糖酵解ATP 產生速率提高，符合腫瘤細胞供能特性［6］。通過無氧糖酵解的能量代謝形式，腫瘤細胞可以增強對缺血、缺氧的耐受性，促進腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉移。如今，抗腫瘤中的糖酵解途徑成為抗癌研究的關注點之一［7］。本研究結果顯示，QFQ 醇提物可以提高肝癌細胞的實時耗氧率，降低肝癌細胞胞外酸化率和質子流出速率，抑制肝癌細胞糖酵解能力，促進肝癌細胞有氧呼吸，細胞供能方式由無氧糖酵解逐漸轉變成氧化磷酸化，從而抑制肝癌細胞生長。

通過Warburg 效應可知，大多數腫瘤細胞即便處于氧氣充足的環境，也會選擇產能效率相對低的糖酵解途徑，以此完成自身供能［8］。首先葡萄糖從血漿轉送至腫瘤細胞胞質主要通過腫瘤細胞膜上高表達的跨膜蛋白Glut1 和Glut3 來完成［9］；待葡萄糖進入細胞后，經HK 等相關酶轉化成丙酮酸，因此HK 也被認為是最重要的糖酵解效應因子之一，它是糖代謝過程中第1 個限速步驟［3］；而后，丙酮酸進入線粒體通過三羧酸循環產生乙酰輔酶A，同時釋放相對多的ATP［10］。此時HIF-1α 能抑制三羧酸循環，同時促進糖酵解途徑，由此提高腫瘤細胞對缺氧環境的耐受性［7］。因此，HIF-1α 是糖酵解途徑中的重要調節因子，可同時調控Gluts 的表達和HK 的活性。可見，Glut1、Glut3、HK、HIF-1α 都是糖酵解途徑的重要蛋白［11］。本研究結果顯示，各濃度QFQ 醇提物均能明顯下調Huh-7 細胞Glut1、Glut3、HK 和HIF-1α 蛋白表達，提示QFQ 可通過抑制糖酵解途徑相關蛋白來抑制肝癌細胞的糖酵解能力。

綜上所述，QFQ 能夠調控Huh-7 細胞能量代謝和糖酵解途徑相關蛋白，抑制細胞糖酵解能力，促進細胞的有氧呼吸，從而達到抑制Huh-7 細胞生長的目的。