紫白膏對大鼠肛周創(chuàng)面愈合及TGF-β1、Smad3表達的影響

王 菁，汪昭楚，李 陽，黃 娟，石 榮

（福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004）

中國有50%～51%的人群罹患不同程度的肛腸疾病，其中以痔瘡患病率最高，達49.14%［1-2］，給社會帶來巨大的醫(yī)療負擔。手術(shù)是臨床治療重度痔瘡、肛瘺、肛周膿腫等肛腸疾病的主要方法。術(shù)后可引起肛周組織不同程度的刺激和損傷，并且肛門傷口位置特殊，持續(xù)受腸道糞菌的污染，易出現(xiàn)傷口延遲愈合和瘢痕組織形成，引起疼痛、肛管狹窄等后遺癥［3］。因此，如何促進肛周創(chuàng)面快速愈合、減少并發(fā)癥產(chǎn)生，是肛腸術(shù)后創(chuàng)面管理的重要問題。中醫(yī)外治法使藥物直達病所而發(fā)揮治療作用［4］，國醫(yī)大師陳民藩教授經(jīng)長期的臨床總結(jié)，研制出用于肛腸疾病外治的中成藥紫白膏。紫白膏能夠改善肛門術(shù)后水腫和疼痛，促進肛門、直腸創(chuàng)面愈合［5-7］，但其具體機制尚不明確。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）/Smad通路在細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積和填補創(chuàng)口中發(fā)揮著重要作用，TGF-β1、Smad3 是其中關(guān)鍵的上下游分子［8-9］。本研究觀察紫白膏對大鼠肛周創(chuàng)面TGF-β1、Smad3 的影響，探討其促愈機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性SD 大鼠40 只，體質(zhì)量250～300 g，購自杭州醫(yī)學院動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)于福建安布瑞生物科技股份有限公司，溫度22～26 ℃，濕度60%～70%，光照12 h/d，許可證號：SYXK（閩）2022-0002。

1.2 實驗藥物 紫白膏（福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，批準號：閩藥制字Z06106031，批號：220210），主要由大黃、紫草、白及、冰片、煅石膏等組成；凡士林（振德醫(yī)療用品股份有限公司，批號：202210235A）；0.9%氯化鈉注射液（福州海王福藥制藥有限公司，批號：220214044）。

1.3 實驗試劑 RIPA 強裂解液（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：MA0151）；苯甲基磺酰氟（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號：KGP610）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo 公司，批號：23209）；超敏化學發(fā)光檢測試劑盒（上海百賽生物技術(shù)股份有限公司，批號：S6009M）；十二烷基硫酸鈉（德國Merck 公司，批號：151-21-3）；β-actin、TGF-β1 抗體（美國Proteintech 公司，批號：66009-1-Ig、21898-1-AP）；Smad3 抗體（北京博奧森生物科技有限公司，批號：bs-3484R）。

1.4 實驗儀器 超低溫冷凍儲存箱（合肥中科美菱低溫科技股份有限公司）；低速迷你離心機（湖南湘儀檢測試驗設(shè)備有限公司）；微量冷凍離心機（美國Beckman 公司）；熒光定量PCR 儀（美國Thermo公司）；PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）；超微量紫外可見光分光光度計（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；低溫研磨機（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）。

2 方 法

2.1 分組及造模 將40 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機分為空白組、模型組、對照組和紫白膏組，每組10 只。各組SD 大鼠參考文獻［10］建立大鼠肛周創(chuàng)面模型。10%水合氯醛按3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉后，用鑷子、剪刀于大鼠肛門周圍部位修剪直徑約為2 cm 的正圓形切口，逐層剪開肛周皮膚的表皮、筋膜直至肌層，止血，以油紗、膠帶固定傷口。除空白組外，其余各組換藥前0.5 h 在創(chuàng)面上滴加糞便提取液1 mL（取健康人新鮮糞便10 g＋生理鹽水5 mL，混勻，離心，取上清）。

2.2 干預措施 空白組和模型組均予生理鹽水紗條濕敷，對照組予凡士林外敷，紫白膏組予中藥紫白膏涂覆創(chuàng)面。具體方法：使用棉簽沾取藥物，完整覆蓋創(chuàng)面，層厚約1 mm。各組干預后予清潔敷料覆蓋，外用膠布固定。每日換藥1 次，連續(xù)換藥14 d，10%水合氯醛按3.5 mL/kg 腹腔注射麻醉，以肛周創(chuàng)面為中心沿創(chuàng)緣剪取組織標本，標記后于-80 ℃冰箱凍存。

2.3 創(chuàng)面愈合率檢測 采用心電圖網(wǎng)格紙（1 小格1 mm）測量大鼠干預前后肛周創(chuàng)傷面積，計算其創(chuàng)面愈合率。

2.4 Western blot 檢測大鼠肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 蛋白表達量 取大鼠肛周創(chuàng)面組織經(jīng)裂解液裂解，勻漿后離心取上清液，BCA 法檢測蛋白濃度。經(jīng)SDS-PAGE 電泳及轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶封閉1 h。加一抗β-actin（1∶8 000）、TGF-β1（1∶3 000）、Smad3（1∶2 000），4 ℃搖床過夜。TBST 溶液清洗，加入二抗稀釋液（1∶5 000）孵育2 h，顯影后用ImageJ 軟件檢測條帶的灰度值。

2.5 qPCR法檢測大鼠肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 mRNA 相對表達水平 取大鼠肛周創(chuàng)面肉芽組織以Trizol 法裂解RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。引物由福州尚亞生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。以GADPH 為內(nèi)參，應(yīng)用SYBR 試劑盒以三步法進行qPCR。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，2 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，SYBR 10 μL，ddH2O 6.8 μL，DyeⅠ 0.4 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預變性1 min，95 ℃變性20 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，擴增40 個循環(huán)。擴增結(jié)束后，根據(jù)每次循環(huán)延伸處收集的熒光信號，采用2-ΔΔCt值對基因進行相對定量。

2.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 4 組肛周創(chuàng)面愈合率比較 與空白組比較，模型組大鼠肛周創(chuàng)面愈合率明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，紫白膏組和對照組大鼠肛周創(chuàng)面愈合率均明顯提高（P均＜0.05）；與對照組比較，紫白膏組大鼠肛周創(chuàng)面愈合率明顯提高（P＜0.05）。見表2。

表2 4 組肛周創(chuàng)面愈合率比較（±s） %

表2 4 組肛周創(chuàng)面愈合率比較（±s） %

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與對照組比較，3） P＜0.05。

創(chuàng)面愈合率87.72±3.29 73.32±2.201）78.12±3.922）84.60±1.992）3）組別空白組模型組對照組紫白膏組n 10 10 10 10

3.2 4 組肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 蛋白表達量比較 與空白組比較，模型組大鼠肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 蛋白表達量均明顯提高（P均＜0.05）；與模型組比較，紫白膏組和對照組大鼠肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 蛋白表達量均明顯降低（P均＜0.05）。見圖1、表3。

表3 4 組肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 蛋白表達量比較（±s）

表3 4 組肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 蛋白表達量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

Smad3 0.36±0.04 0.98±0.111）0.61±0.092）0.56±0.092）組別空白組模型組對照組紫白膏組n 10 10 10 10 TGF-β1 0.41±0.03 1.07±0.071）0.63±0.062）0.56±0.072）

3.3 4 組肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 mRNA 相對表達水平比較 與空白組比較，模型組大鼠肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 mRNA 相對表達水平明顯提高（P＜0.05）；與模型組比較，紫白膏組和對照組大鼠肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 mRNA 相對表達水平均明顯降低（P＜0.05）；與對照組比較，紫白膏組大鼠肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 mRNA 相對表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表4。

表4 4 組肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 mRNA相對表達水平比較（±s）

表4 4 組肛周創(chuàng)面組織TGF-β1、Smad3 mRNA相對表達水平比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05；與對照組比較，3） P＜0.05。

Smad3 1.00±0.07 1.85±0.041）1.51±0.032）1.37±0.072）3）組別空白組模型組對照組紫白膏組n 10 10 10 10 TGF-β1 1.00±0.08 1.99±0.051）1.38±0.012）1.21±0.012）3）

4 討 論

紫白膏質(zhì)地細膩，可減少患處創(chuàng)面摩擦，降低患者在愈合過程中的不適感，保護創(chuàng)面，加速愈合，并有助于改善肛腸疾病局部并發(fā)癥。紫白膏含有大黃、紫草、白及、煅石膏、冰片等中藥，具有清熱、涼血、生肌等功效。其中大黃、紫草為紫白膏的君藥，可清熱、解毒、涼血；白及、煅石膏為臣藥，可收斂止血、消腫生肌；輔以冰片宣毒防腐、清熱止痛。前期研究發(fā)現(xiàn)，紫白膏可通過調(diào)控肛周創(chuàng)面模型大鼠血漿IL-6、IL-10 水平實現(xiàn)術(shù)后鎮(zhèn)痛、凝血［11］，并且有效提高堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）的表達并促進大鼠創(chuàng)面的修復［6］。

肛門創(chuàng)面的修復是動態(tài)的過程，需要在快速愈合與瘢痕增生的矛盾點中取得平衡，既滿足外科快速康復理念，又避免不良愈合帶給患者心理和經(jīng)濟負擔。在肛門修復的早期，免疫細胞進入損傷區(qū)域，釋放出生長因子，使創(chuàng)面周圍細胞增殖、移動與分化［12-13］。在創(chuàng)口填充的過程中，隨著ECM 的沉積，局部壞死組織被溶解和吸收，肉芽組織逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)橐阅z原纖維為主的瘢痕［14］。在以上過程中，細胞因子通過信號傳遞發(fā)揮著免疫調(diào)節(jié)、刺激細胞增殖的重要作用［15-16］。

TGF-β1/Smad 通路的動態(tài)調(diào)節(jié)影響著創(chuàng)面的良性或不良愈合［17-18］。TGF-β1 是轉(zhuǎn)化生長因子家族中的主要成員之一，可促進成纖維細胞增殖以及ECM 沉積，TGF-β1 與跨膜受體結(jié)合，激活下游分子產(chǎn)生級聯(lián)效應(yīng)［19-20］。Smad3 是TGF-β1/Smad 信號通路下游的信號傳遞分子［21］，它可被受體樣活化性激酶5（ALK5）磷酸化并介導胞外刺激傳遞到核內(nèi)，通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP-1）的合成參與調(diào)節(jié)ECM［22］。在病理性狀態(tài)下，TGF-β1 對膜受體的激活可引起Smad3 的表達上調(diào)，從而導致瘢痕增生［23］。研究表明在增生性瘢痕（hypertrophicscar，HTS）的典型不良愈合狀態(tài)下，TGF-β1 mRNA 表達水平和蛋白表達明顯高于正常皮膚［24］。因此創(chuàng)面良性愈合與TGF-β1、Smad3 的合理表達具有密切關(guān)系。在大鼠創(chuàng)面治療后14 d，屬于創(chuàng)面愈合的肉芽增生末期或上皮化期，此時由于TGF-β1/Smad 通路的激活，創(chuàng)面的膠原和纖維蛋白增加，從而加速創(chuàng)面填充，容易產(chǎn)生瘢痕的過分堆積。因此，此階段的藥物干預及關(guān)鍵分子檢測對于臨床具有意義。

本研究結(jié)果顯示，紫白膏組的創(chuàng)面愈合率與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義，且明顯高于模型組和對照組，表明使用紫白膏治療后，大鼠肛周創(chuàng)面的愈合情況與未受糞便菌群污染的空白組類似。與空白組相比，模型組治療第14天創(chuàng)面組織中TGFβ1、Smad3 表達升高，因模型組加入了糞便菌群而未進行有效干預，屬于感染傷口，表明TGF-β1、Smad3 的激活可能與創(chuàng)面受炎癥刺激后的非良性愈合有關(guān)。紫白膏組TGF-β1、Smad3 蛋白表達和mRNA 水平較模型組和對照組明顯降低，表明在大鼠肛周創(chuàng)面愈合后期，紫白膏可能通過下調(diào)TGF-β 1、Smad3 的表達，減輕創(chuàng)面病理性瘢痕增生以促進創(chuàng)面的良性愈合。

在今后的研究中，需要進一步明確紫白膏對不同創(chuàng)面愈合階段TGF-β1/Smad 通路上下游分子表達的差異，如紫白膏對大鼠創(chuàng)面基質(zhì)金屬蛋白酶、膠原蛋白等終產(chǎn)物的影響，深入發(fā)掘紫白膏的作用機制。