中醫(yī)正骨理論指導下大鼠股骨干骨折髓內(nèi)固定模型的實驗研究

牛素生，杜夢凡，劉俊寧，張 燕，趙常云蕾，黃茂暢，郭 雙

（1.福建中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，福建 福州 350122；2.中醫(yī)骨傷及運動康復教育部重點實驗室，福建 福州 350122；3.南方醫(yī)科大學中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州 510315；4.黃岡市婦幼保健院，湖北 黃岡 438000）

骨折是骨傷科最常見的臨床病癥，愈合過程漫長而復雜，容易受多種因素的影響。骨折愈合模型研究多用大鼠，其脛骨和股骨屬于長骨，常用來作為骨折的模型，其中股骨是更理想的骨折模型［1］，常用的制作方法有開放截骨模型和閉合骨折模型。開放截骨模型在國內(nèi)應用較多［2-4］，但內(nèi)固定時對膝關(guān)節(jié)造成干擾［5］，造成股骨骨折的方法有暴力打擊［6-7］和線鋸［8-9］或擺鋸鋸斷［10-12］，切口約需3 cm［9］，創(chuàng)傷大，出血多。固定方式選擇上也存在較大差異［7，10，13-14］，導致股骨骨折和固定方式缺乏統(tǒng)一的標準，模型均一性差。本研究先對大鼠股骨相關(guān)解剖參數(shù)進行研究，顯露股骨后用低速電鋸截斷造成股骨骨折，再結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)正骨復位手法，采用克氏針進行髓內(nèi)固定，建立大鼠股骨骨折髓內(nèi)釘內(nèi)固定模型，為骨折愈合的相關(guān)研究提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 3 月齡SPF 級SD 雌性大鼠18 只，體質(zhì)量（170±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2020-0049，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學醫(yī)學實驗動物中心，許可證號：SYXK（閩）2019-0007。單籠5 只飼養(yǎng)，自由飲水與進食（標準SPF 飼料），室溫20～25 ℃，相對濕度45%，12 h 光照/12 h 黑暗。實驗方案通過福建中醫(yī)藥大學動物倫理委員會審查并獲得批準（FJTCM IACUC 2020032）。

1.2 器械及材料 A071008 微型電鉆（安徽阿斯珈工具有限公司）；微型鋸片（阿斯珈 圓形，Φ2 cm，厚度0.1 mm）、持針器、縫合針、克氏針（天津市宇通醫(yī)療器械廠）；310-1FA/9 讀數(shù)顯微鏡（長春市第三光學儀器廠）；DL92150P 游標卡尺（得力集團有限公司）；小動物X 線機（美國Kubtec 公司）；TreadScan步態(tài)分析系統(tǒng)（美國CleverSys公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 股骨解剖參數(shù)測量 取8 只SD 大鼠，2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg 腹腔注射麻醉后，游離雙側(cè)股骨，其中左側(cè)股骨用于股骨長度和髓腔有效長度的測量。測量時用游標卡尺測量股骨大轉(zhuǎn)子頂點至股骨髁平面的距離即為股骨長度，再用薄鋸片將大鼠股骨沿矢狀位縱行剖開，用克氏針頂端將干骺端髓內(nèi)松質(zhì)骨盡量推擠，直至無法移動后用游標卡尺測量其髓腔長度。右側(cè)股骨分別用電鋸片自中點、中上1/3 交界和中下1/3 交界處橫行切斷，觀察髓腔形態(tài)，并以短軸為準用讀數(shù)顯微鏡測量內(nèi)徑。

結(jié)果顯示，股骨中點髓腔橫斷面形態(tài)近似橢圓形，遠端橫斷面近似長方形，近端橫斷面近似三角形，矢狀位觀察大鼠股骨髓腔稍呈弧形。大鼠股骨全長為（36.40±0.22）mm，髓腔的有效長度為（23.59±0.17）mm，股骨髓腔的近1/3、中點和遠1/3 依次為（1.64±0.15）、（1.60±0.21）、（1.94±0.33）mm。基于此，后續(xù)內(nèi)固定選取直徑1.5 mm、長度21 mm 的克氏針內(nèi)固定。

2.2 骨折髓內(nèi)固定模型建立 另取3 月齡SD 雌性大鼠10 只，2%戊巴比妥鈉水溶液按40 mg/kg 腹腔注射麻醉后取俯臥位，雙下肢呈蛙式位固定放置，剃除毛發(fā)。

2.2.1 顯露股骨 用手觸摸股骨遠近端（膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)）和股骨走行并做標記，以股骨中點為中心沿股骨走行做一約0.6 cm 斜形切口深至筋膜層（見圖1A），可見股外側(cè)肌和股二頭肌外側(cè)之間隙白色深筋膜間隔，沿肌間隙分離直至股骨表面，用手術(shù)刀片沿股骨表面縱行切開骨膜，再用2 把彎頭眼科鑷緊貼股骨表面分離骨膜并置于股骨兩側(cè)，捏緊鑷子后以股骨中點為中心向遠近端縱行剝離骨膜（見圖1B），暴露股骨約0.6 cm，暴露部分的中心位置即為股骨中點。

圖1 開放式骨折髓內(nèi)固定模型建立圖

2.2.2 截斷股骨 將其中1 把眼科鑷彎頭向上貼緊骨面置于股骨前側(cè)，另1 把彎頭鑷于對側(cè)同樣操作，將2 把彎頭鑷向兩邊撐開，用直徑2 cm、厚度0.1 mm 的電動鋸片垂直股骨縱軸切割（5 000 r/min，切割時為防止骨骼灼傷，用生理鹽水不停滴截骨處）（見圖1C），直至股骨橫截面的3/4，取下眼科鑷，用2 把持針器分別輕輕夾持股骨切割口遠近端，同時向同一方向稍用力將股骨掰斷，造成股骨橫斷骨折。

2.2.3 復位固定股骨 2 把持針器繼續(xù)夾持骨折遠近端稍做翻轉(zhuǎn)，將骨折端向外側(cè)成角，根據(jù)以上骨髓腔測量數(shù)據(jù)，選取一直徑1.5 mm、長度21 mm 的克氏針，先插入骨折遠端骨髓腔，夾持遠端骨干的持針器移到裸露的克氏針，一助手用“拔伸牽引”的手法持續(xù)牽拉骨折以遠的下肢，按骨折復位時“子求母”的原則，采用“折頂”的復位手法，先加大骨折端成角，由骨折遠端裸露的克氏針尋找并插入近端骨髓腔，分別握持骨折遠近端做縱向推擠（見圖1D）。再次顯露骨折端檢查骨折斷端無分離，骨折端穩(wěn)定，生理鹽水沖洗切口后逐層縫合關(guān)閉切口。所有大鼠無意外死亡情況發(fā)生。

2.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組內(nèi)不同時間點比較采用重復測量方差分析，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2.4 下肢步態(tài)分析 采用TreadScan 步態(tài)分析系統(tǒng)分析10 只右側(cè)股骨骨折髓內(nèi)固定大鼠術(shù)后5 h、術(shù)后2 周和術(shù)后4 周的下肢步態(tài)，觀察大鼠雙側(cè)下肢活動情況。該系統(tǒng)通過高速彩色攝像機以100 幀/s的速度完整捕捉大鼠在透明穿梭跑帶上的活動情況，并將捕獲的足印傳送到對應的運行步態(tài)分析系統(tǒng)生成視頻文件，將獲得的視頻在軟件內(nèi)進行兩側(cè)足擺動時間、足印長度、足間距、步數(shù)和邁步頻率等數(shù)據(jù)進行分析。分析時，先將大鼠隨機放置于步態(tài)分析系統(tǒng)上適應5 min 后再開始。

與健側(cè)比較，手術(shù)側(cè)術(shù)后5 h 擺動時間明顯延長（P＜0.05），足印長度、足間距均明顯縮短（P＜0.05），步數(shù)、邁步頻率均明顯減少（P＜0.05）；術(shù)后2 周足印長度明顯減小（P＜0.05）；術(shù)后4 周雙側(cè)下肢步態(tài)分析指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與手術(shù)側(cè)術(shù)后5 h比較，術(shù)后2周步數(shù)明顯減少（P＜0.05）；術(shù)后4 周雙足擺動時間明顯延長（P＜0.05），足印長度明顯縮短（P＜0.05），步數(shù)明顯減少（P＜0.05）。見表1。

表1 雙側(cè)大鼠術(shù)后不同時間下肢步態(tài)分析比較（±s）

表1 雙側(cè)大鼠術(shù)后不同時間下肢步態(tài)分析比較（±s）

注：與健側(cè)比較，1） P＜0.05；與術(shù)后5 h 比較，2） P＜0.05。

n 組別邁步頻率/Hz 2.28±0.45 1.75±0.33 1.96±0.65 1.80±0.421）1.62±0.30 1.59±0.44健側(cè)10手術(shù)側(cè)10時間術(shù)后5 h術(shù)后2周術(shù)后4周術(shù)后5 h術(shù)后2周術(shù)后4周擺動時間/ms 209.68±55.26 336.45±156.70 425.40±131.72 300.30±106.921）335.60±142.73 436.20±165.642）足印長度/mm 32.54±4.06 34.46±4.07 15.86±8.81 24.72±4.261）26.88±3.931）16.82±7.192）足間距/mm 124.15±32.56 99.61±18.10 97.93±27.28 95.82±25.631）102.02±16.09 107.39±23.37步數(shù)21.50±4.65 15.90±3.41 16.70±7.54 17.60±2.171）14.40±2.952）14.40±3.632）

2.5 股骨骨折及髓內(nèi)固定情況觀察 下肢步態(tài)分析結(jié)束后，用2%戊巴比妥鈉按40 mg/kg 進行腹腔注射麻醉，麻醉成功后取俯臥位，用小動物X 線機進行手術(shù)側(cè)股骨X 線攝影，觀察骨折端對位、固定及愈合情況。

術(shù)后X 線攝影顯示骨折對位對線情況良好；術(shù)后2 周可見骨折端對位對線良好，骨折線存在，骨折周圍有少量骨痂生長；術(shù)后4 周可見骨折端大量骨痂生長，骨痂通過骨折線，骨折線稍變模糊。見圖2。

圖2 大鼠骨折髓內(nèi)固定術(shù)后X 線影像圖

3 討 論

在傳統(tǒng)的骨折動物模型中，Einhorn 動物骨折造模方法被視為經(jīng)典，在國外被廣泛應用，但因該方法所需器械復雜，國內(nèi)使用并不多［15］。國內(nèi)一般以開放截骨模型更為多見，常用的方法有Metineren 法［5］和在此基礎(chǔ)上的改良方法，操作時需暴露大鼠膝關(guān)節(jié)并將髕骨脫位，將內(nèi)固定物由股骨髁穿入股骨髓腔內(nèi)直至穿出股骨大轉(zhuǎn)子，然后再用特制的裝置擊打造成股骨骨折髓內(nèi)固定模型［6-7］，該方法需暴露膝關(guān)節(jié)，髓內(nèi)固定物穿過股骨髁和大轉(zhuǎn)子，對髖、膝關(guān)節(jié)產(chǎn)生明顯影響，且是在內(nèi)固定物插入髓腔內(nèi)后再進行擊打，股骨發(fā)生骨折的同時內(nèi)固定物也出現(xiàn)相應程度的變形，骨折在一定程度的成角移位狀況下愈合，影響模型鼠下肢的功能，也會對骨折愈合產(chǎn)生干擾。有學者將股骨暴露后直接用剪刀剪斷股骨［16-17］，此方法容易導致股骨碎裂，后期固定困難且容易發(fā)生短縮移位。有文獻報道采用持續(xù)局部加壓方法導致骨折［18］，但對具體操作方法表述不詳。本研究在總結(jié)以上方案的不足后充分利用局部的解剖條件，僅需做0.6 cm 長切口，從肌肉間隙直接顯露股骨，無需切開肌肉，用厚度為0.1 mm 鋸片從股骨中點進行截斷，對髖、膝關(guān)節(jié)不造成干擾，該方法導致骨折類型為橫形，且鋸斷股骨干3/4 后將剩余股骨折斷，形成鋸齒狀骨折斷面，有助于骨折端對位和內(nèi)固定后的穩(wěn)定性，防止骨骼發(fā)生短縮或旋轉(zhuǎn)移位。

大鼠股骨細小，釘板系統(tǒng)固定困難，因此股骨骨折模型固定時大多采用髓內(nèi)固定的方法。但以往髓內(nèi)固定物選擇較為隨意，且選擇證據(jù)不充分，主要有直徑為1.0、1.5 mm 的克氏針和5、20 mL 注射器針頭等［7，13-14］，也有文獻并未明確內(nèi)固定物的直徑［10］。若髓內(nèi)固定物太粗，無法順利進行髓內(nèi)固定；若內(nèi)固定物過細，則不足以維持骨折斷端的穩(wěn)定性，對骨折愈合產(chǎn)生直接影響。本研究先對大鼠股骨相關(guān)參數(shù)進行測量，結(jié)果顯示3 月齡SD 大鼠股骨不同部位髓腔形態(tài)有所差別，股骨正中間位置即為股骨髓腔最窄處，所以選用直徑1.5 mm、長度21 mm 的克氏針做髓內(nèi)固定，既能保證順利插入髓腔，又能同時保證骨折端的有效穩(wěn)定。

骨折手法整復是中醫(yī)骨傷科特色治療方法之一，中醫(yī)正骨在中醫(yī)骨傷科的應用廣泛，其臨床價值已被廣泛證實［19-20］。在整復過程中先固定骨折近端，再用骨折遠端尋找骨折近端并對合，即“子求母”的原則。這種復位方法對周圍軟組織的損傷較小，有利于骨折的愈合。“折頂”復位法是針對用拔伸牽引無法糾正骨折重疊移位時采用的特定正骨手法，操作時需先增大骨折端的成角，當骨折遠近端皮質(zhì)已經(jīng)相頂時，再驟然反折使重疊移位得以矯正，以避免在反復復位過程中產(chǎn)生不必要的損傷［19］。本實驗在顯露骨折端后，如果采用拔伸牽引的方法強行將骨折端分離，容易過度牽拉導致下肢肌肉和神經(jīng)的損傷。因此在復位時先將克氏針插入骨折遠端髓腔，維持拔伸牽引，用持針器夾持骨折近端和遠端裸露的克氏針，先逐漸加大骨折端成角，直視下將克氏針插入骨折近端髓腔后再順勢反折，髓內(nèi)釘即可順利插入近端髓腔，有效避免肌肉和神經(jīng)損傷。

術(shù)后下肢步態(tài)分析結(jié)果顯示，手術(shù)側(cè)術(shù)后5 h擺動時間明顯延長，足印長度和足間距明顯縮短，步數(shù)、邁步頻率均明顯減少，考慮系術(shù)后手術(shù)側(cè)疼痛所致。隨著時間的推移，手術(shù)側(cè)下肢各運動指標均逐漸改善，至術(shù)后4 周時，兩側(cè)下肢各運動指標比較差異無統(tǒng)計學意義，說明骨折端具有良好的穩(wěn)定性。X 線片結(jié)果也顯示骨折端對位對線良好，達到解剖復位，克氏針位于髓腔內(nèi)位置良好，未造成膝、髖關(guān)節(jié)的損傷，骨折端逐漸有骨痂生長并越過骨折線，骨折愈合情況良好，提示該模型能夠成功建立。

綜上，本造模方法是在中醫(yī)正骨理論指導下完成，具有創(chuàng)傷小、操作簡單、模型均一性好、可復制性高等優(yōu)點，值得推廣應用。但由于條件所限，本研究只對3 月齡SD 雌性大鼠股骨相關(guān)參數(shù)進行研究，對其他品系及月齡的大鼠尚需進一步補充和完善。