烏頭湯對白細胞介素-1β誘導的退變軟骨細胞外基質穩態的影響

邱志偉，付長龍，李宇濤，金靈璐，涂海水，仲衛紅

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學中醫學院，福建 福州 350122；4.福建中醫藥大學附屬康復醫院，福建 福州 350003；5.福建省康復技術重點實驗室，福建 福州 350003）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是目前最常見的慢性退行性關節疾病，是由各種因素導致的軟骨退變、軟骨下骨硬化和骨贅形成［1］。OA 患者常伴有關節疼痛、腫脹、畸形、活動受限和關節功能喪失，嚴重影響患者生活。目前臨床多采用物理治療、康復訓練、藥物及手術治療等方式延緩OA 疾病進程，但治療周期較長，費用較高，治療效果仍有待提高，因此尋找治療OA 的有效方法，并探討其發病機制是目前醫療界亟需解決的問題之一［2］。關節軟骨主要由軟骨細胞和軟骨細胞外基質（extracellular matrix，ECM）組成。ECM 可以為關節提供加壓能力，使關節具有強大的承重能力，防止軟骨受到機械應力的破壞，因此ECM 是影響關節穩定性和關節軟骨結構完整性的重要因素［3］。前期臨床研究發現，烏頭湯可有效改善骨關節炎患者關節功能障礙，提高關節活動度［4］，但其具體作用機制尚不明確。本研究選用烏頭湯作為干預媒介，以白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）誘導的退變軟骨細胞作為研究載體，觀察烏頭湯對退變軟骨細胞ECM 穩態的影響，為其臨床應用提供理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 4 周齡SPF 級SD 雄性大鼠10 只，體質量（90±10）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005。飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心，恒溫恒濕，常規飼養7 d，許可證號：SYXK（閩）2019-0007。所有實驗程序均經福建中醫藥大學動物實驗倫理委員會批準（2019122）。

1.2 實驗藥物 烏頭湯藥物組成：制川烏6 g，麻黃9 g，黃芪9 g，炙甘草9 g，芍藥9 g，由福建中醫藥大學第三人民醫院提供。烏頭湯水提物制備：制川烏先煎1 h，隨后再依次加入其余4 味藥材煎煮1 h；用濾網過濾烏頭湯藥液，除去殘渣，將藥液放入旋轉蒸發儀中制備成浸膏，隨后通過水浴裝置60 ℃條件下將其蒸干；蒸干后轉移至低溫冰上將其緩慢研磨至粉末狀。將烏頭湯浸膏粉末和含5 %胎牛血清（FBS）的DMEM 培養基在超聲波下進行充分混勻，最終配制濃度為10 mg/mL 烏頭湯水提物，0.22 μm無菌濾膜過濾后于4 °C 冰箱存放待用。

1.3 實驗試劑 Ⅱ型膠原酶、IL-1β 試劑盒購自美國Sigma 公司（批號：MKCL5731、12393）；GAPDH 抗體、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-13 抗體和山羊抗兔二抗均購自美國Proteintech 公司（批號：10494-1-AP、18165-1-AP、SA00001-2）；MMP-3、含Ⅰ型血小板結合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintesrin and metalloprotease with thrombospondin type Ⅰ motifs，ADAMTS）-4 抗 體、ADAMTS-5 均購自北京博奧森生物技術有限公司（貨號：bs-0413R、bs-4191R、bs-3573R）；RNA 提取試劑、逆轉錄試劑盒均購自南京諾唯贊生物技術有限公司（貨號：R401-01、R211-02）。

1.4 實驗儀器 ELx800 全自動酶標儀（美國Bio-Tek 公司）；CFX96 Touch 實時定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 方 法

2.1 大鼠原代軟骨細胞培養 使用面罩在2 L/min氣體流量中用5%異氟醚麻醉SD 大鼠，并采用人工脫頸法處死。大鼠雙膝及周圍部位用75%乙醇消毒，雙膝關節分離后帶入超凈臺內操作。PBS 緩沖液清洗分離的大鼠膝關節，將透明軟骨小心剃取，置于無菌培養皿內，并切碎至約1 mm3大小。再次使用PBS 緩沖液清洗切碎的軟骨，加入0.2%的Ⅱ型膠原酶后置入37 ℃、5% CO2的培養箱中消化。約4～6 h 后可消化完全，轉移至無菌離心管中于1 000 r/min 下離心3 min。結束后去除上層上清液，往下層沉淀組織中加入含有10% FBS 的DMEM 培養基終止消化，并將其轉移到培養瓶中培養，每2 d換1 次液。鏡下觀察并拍照記錄軟骨細胞的生長速度及形態，在其占滿培養瓶的80%時及時進行傳代培養。觀察到軟骨細胞傳代到第3 和第4 代時容易產生大量的去分化軟骨細胞，軟骨細胞的表型就會丟失，因此我們選擇第2 代軟骨細胞進行后續實驗。

2.2 分組和干預 將第2 代軟骨細胞懸液以1×105/mL 密度移至6 孔板，隨機將軟骨細胞分為空白組、模型組和烏頭湯組。空白組使用含10%FBS 的DMEM 培養基進行培養；模型組采用10 ng/mL IL-1β 干 預24 h 復 制 退 變 軟 骨 細 胞 模型［5］；烏頭湯組采用10 ng/mL IL-1β 干預24 h 后使用150 μg/mL烏頭湯水提物干預24 h［6］。

2.3 qPCR 檢 測軟 骨細 胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和ADAMTS-5 mRNA 相對表達水平 根據Trizol 試劑說明書提取軟骨細胞總RNA，檢測RNA濃度。對qPCR 擴增曲線和溶出曲線進行確認，采用2-△△Ct方法比較目的基因與內參基因平均CT 值差異，并對結果進行定量。PCR 引物由福州尚亞生物有限公司設計，引物序列見表1。

2.4 Western blot檢測軟骨細胞中MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5蛋白表達量 提取各組軟骨細胞總蛋白，BCA 定量后高溫變性處理，進行電泳、轉膜、封閉，4 ℃條件下置于GAPDH（1∶10 000）、MMP-3（1∶1 000）、MMP-13（1∶1 000）、ADAMTS-4（1∶1 000）、ADAMTS-5（1∶1 000）一抗孵育過夜。隔天置于山羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，清洗后于PVDF 膜上滴加ECL 發光液進行顯像處理。使用Image Lab 圖像處理軟件，比較顯影條帶中各指標的灰度值與內參灰度值并分析儲存。

2.5 統計學方法 采用SPSS 26.0 軟件進行統計分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊時采用LSD-t法，方差不齊時采用Game's-Howell 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 軟骨細胞形態觀察 大鼠原代軟骨細胞在第6 天呈現不規則多邊形附著于培養瓶上，見圖1A；在第8 天以具有清晰細胞核的長紡錘線分布在培養瓶中，見圖1B。傳代后的第1 代軟骨細胞在培養第5 天均勻分布在培養瓶上，雜質減少，貼壁時間縮短，見圖1C。第2 代軟骨細胞在第10 天占據培養瓶的80%以上面積，細胞形態良好，細胞核清晰，胞漿豐富，見圖1D。

3.2 3 組軟骨細胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和ADAMTS-5的mRNA 相對表達水平比較 與空白組比較，模型組MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和ADAMTS-5 mRNA 相對表達水平明顯提高（P＜0.05）；與模型組比較，烏頭湯組MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和ADAMTS-5 mRNA 相對表達水平明顯降低（P＜0.05）。見表2。

表2 3 組軟骨細胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和ADAMTS-5 mRNA 相對表達水平比較（±s）

表2 3 組軟骨細胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和ADAMTS-5 mRNA 相對表達水平比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

ADAMTS-5 1.00±0.00 5.30±0.491）2.16±0.212）組別空白組模型組烏頭湯組n3 3 3 MMP-3 1.00±0.00 4.53±0.481）2.96±0.212）MMP-13 1.00±0.00 5.72±0.171）4.41±0.162）ADAMTS-4 1.00±0.00 3.94±0.441）2.08±0.112）

3.3 3 組軟骨細胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和ADAMTS-5 蛋白表達量比較 與空白組比較，模型組MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和ADAMTS-5 蛋白表達量明顯提高（P＜0.05）；與模型組比較，烏頭湯組MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4和ADAMTS-5蛋白表達量明顯降低（P＜0.05）。見表3、圖2。

圖2 3 組軟骨細胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和ADAMTS-5 蛋白條帶圖

表3 3 組軟骨細胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和ADAMTS-5 蛋白表達量比較（±s）

表3 3 組軟骨細胞MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和ADAMTS-5 蛋白表達量比較（±s）

注：與空白組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。

ADAMTS-5 0.27±0.05 0.81±0.051）0.38±0.042）組別空白組模型組烏頭湯組n3 3 3 MMP-3 0.23±0.01 0.79±0.071）0.36±0.052）MMP-13 0.39±0.02 0.85±0.021）0.55±0.422）ADAMTS-4 0.20±0.23 0.66±0.711）0.48±0.442）

4 討 論

OA 作為一種疼痛性關節疾病，其特征包括關節軟骨退行性改變和周圍組織的病理變化。由于關節中ECM 的存在，機體在正常情況下可以承受數倍于體質量的壓力，而關節軟骨內卻不產生摩擦［7］。這是由于ECM 通過蛋白聚糖和基質細胞蛋白等非纖維狀分子相互連接，形成復雜的網絡，該網絡為關節提供結構完整性和組織功能所必需的機械特性［8］。在OA 患者中ECM 降解加劇并作為最主要的組織病理學特征。烏頭湯出自《金匱要略》：“病歷節不可屈伸，疼痛，烏頭湯主之”“烏頭湯方，治腳氣，不可屈伸”，是臨床治療OA 的經方之一，功擅散寒除濕、溫經通絡［9］。方中以制川烏為君，主行溫陽散寒除濕，止關節痹痛、屈伸不利；佐以麻黃為臣，重在祛風散寒、溫通經絡；黃芪益氣補血；甘草緩急止痛、調和諸藥；芍藥緩解關節痹痛。五味藥相輔相成，共奏溫陽散寒、祛濕止痛、通利關節之功效［10］。烏頭湯具有抗炎鎮痛及改善微循環等作用［11］，可改善關節機械性痛閾及局部皮溫［12］，恢復OA 患者膝關節活動，有效緩解關節疼痛，提高活動度。

MMP-3 和MMP-13 分別屬于MMPs 中的間質溶解素和膠原酶，與OA 發展密切相關，它們可通過降解蛋白多糖和變性膠原進而促進OA 發展［13-14］。MMP-13 作為膠原酶通過切割Ⅱ型膠原參與軟骨降解［15］，而MMP-3 作為間質溶解素可以通過降解ECM 片段從而加劇軟骨降解［16］。在OA 疾病中ECM合成和降解失衡，MMP-3 和MMP-13 表達升高加劇了OA 進展。本研究選用10 ng/mL IL-1β 溶液干預第2 代軟骨細胞24 h，復制退變軟骨細胞［17］。與空白組相比，模型組軟骨細胞中MMP-3 和MMP-13的mRNA 相對表達水平和蛋白表達量明顯提高，加速ECM 降解，研究結果與文獻相符［18］。

ADAMTS 的分泌異常是導致ECM 中蛋白多糖降解的主要因素［19］。ADAMTS 是由19 種金屬蛋白酶組成的家族，其中ADAMTS-4 和ADAMTS-5 是在人類OA 關節軟骨中發現的主要聚集蛋白聚糖酶，它們在IGD 區域的Glu373-Ala374 位點處切割聚集蛋白聚糖，促進蛋白多糖的降解［20］。本研究結果顯示，與空白組比較，模型組ADAMTS-4 和ADAMTS-5 mRNA 相對表達水平和蛋白表達量明顯提高。ADAMTS-4 和ADAMTS-5 分泌異常導致蛋白多糖被水解，破壞軟骨穩態，加劇ECM 降解，影響關節組織抗壓能力，進一步誘導關節軟骨退化。本研究結果表明，經過烏頭湯干預后，軟骨細胞中MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4、ADAMTS-5 的異常表達得到改善，防止ECM 中Ⅱ型膠原降解以及蛋白多糖的水解，抑制ECM 降解。

綜上所述，烏頭湯通過抑制MMP-3、MMP-13、ADAMTS-4 和ADAMTS-5 表達來維持軟骨細胞外基質穩態，延緩OA 軟骨退變。但是本研究仍存在部分不足之處，例如只進行了體外細胞實驗，以及尚未對烏頭湯和痹癥相關證型之間的關系進行深入分析。因此，后續會考慮納入寒濕痹癥OA 大鼠模型，觀察烏頭湯對寒濕痹癥OA 大鼠的治療效果。