基于網絡藥理學和實驗驗證探討異蓮心堿治療高血壓的作用機制

姚夢瀅，吳與倫，吳美珠，魏麗慧，周鈺婷，彭 軍，沈阿靈，4，陳友琴

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學科技創新與轉化中心，福建 福州 350122；4.美國凱斯西儲大學醫學院，俄亥俄州 克利夫蘭 44106）

高血壓病是我國最常見的慢性疾病，長期高血壓會引起心、腦、腎、血管等靶器官損害，嚴重危害人類健康［1］。血管功能性病變是貫穿高血壓全過程的重要病理變化，腎素-血管緊張素-醛固酮（RAAS）系統激活的血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）會刺激血管平滑肌細胞發生增殖、遷移等表型轉化［2-3］，最終導致血管重構，使高血壓進一步加重。因此，防治血管平滑肌的增殖是減輕血管重構、抑制血壓進一步升高的重要措施。蓮子心具有清心火、泄肝火的功效［4］，其有效成分為生物堿類化合物［5］，異蓮心堿是從蓮子心中分離出的一種雙芐基異喹啉類生物堿［6］，具有抗心律失常、抗氧化的作用［7-8］，但其是否能治療高血壓及其作用機制仍有待進一步研究。

近年來，網絡藥理學已被廣泛應用于中醫藥的研究［9-10］，可以多維度、多靶點為藥物防治疾病提供新視角和新依據［11］。因此，本研究將首先構建高血壓模型小鼠以探究異蓮心堿對血壓的影響，進一步通過網絡藥理學分析異蓮心堿治療高血壓病的靶點和機制，并進行細胞實驗驗證相關機制，以期為異蓮心堿的臨床應用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞和動物 大鼠胸大動脈平滑肌細胞A7R5 購自武漢普諾賽生命科技有限公司。6～8 周齡的SPF 級C57BL/6 雄性小鼠24 只，體質量（25±3）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（滬）2022-0004，飼養于福建中醫藥大學實驗動物中心SPF 級實驗室，許可證號：SYXK（閩）2019-0007。本實驗已通過福建中醫藥大學倫理委員會批準（FJTCM IACUC 2022026）。

1.2 實驗藥材 異蓮心堿購自鑰準醫藥科技（上海）有限公司，純度＞98%；Ang Ⅱ購自美國Abcam公司；纈沙坦購自美國Sigma 公司。進行動物實驗時，藥物均用蒸餾水配制；進行細胞實驗時，異蓮心堿用DMSO 配制。

1.3 實驗試劑 胰酶、胎牛血清均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司（貨號：25200072、10099141C）；DMEM 培養基（美國Gibco 公司，貨號：8123122）；伊紅、蘇木素均購自北京索萊寶科技有限公司（貨號：G1100、G1140）；蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）一抗和羊抗兔二抗均購自美國CST 公司（貨號：4060、4691、4257、7074）；Ang Ⅱ、磷酸化PI3K（p-PI3K）、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體均購自英國Abcam公司（貨號：120183、ab182651、ab29）。

1.4 實驗儀器 CODA 無創鼠尾血壓測量儀（美國Kent Scientific 公司）；植入式膠囊微滲透壓泵（美國Alzet 公司）；彩色多普勒超聲診斷儀（加拿大Visual Sonics 公司）；光學顯微鏡、全自動石蠟切片機（德國Leica 公司）；CO2培養箱、超凈工作臺均購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；酶標儀（美國Bio Tek公司）；電泳儀（美國Bio-Red 公司）；組織包埋機（中國孝感亞光有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物實驗

2.1.1 動物造模與干預 24 只雄性SPF 級C57BL/6小鼠適應性喂養 1 周后，采用隨機數字表法分為對照組、模型組、異蓮心堿組和纈沙坦組，每組6 只。模型組和給藥組采用皮下埋泵法，在小鼠肩胛背部植入含有Ang Ⅱ溶液的膠囊微滲透壓泵，以500 ng/（kg·min）持續釋放Ang Ⅱ溶液，持續4 周，建立高血壓小鼠模型［12］，收縮壓≥140 mm Hg 和（或）舒張壓≥90 mm Hg 即視為造模成功；對照組在小鼠肩胛背部皮下植入不含Ang Ⅱ的膠囊微滲透壓泵，同期泵入生理鹽水。根據不同給藥途徑之間的劑量換算表以及人與各類動物給藥劑量的換算關系［8］，異蓮心堿組按10.5 mL/（kg·d）予異蓮心堿藥液灌胃，纈沙坦組按15 mL/（kg·d）予纈沙坦藥液灌胃，對照組和模型組予等體積的雙蒸水，連續灌胃給藥4 周。

2.1.2 尾動脈血壓儀檢測小鼠血壓變化 應用CODA 無創鼠尾血壓計分別于造模前1 d 及造模干預后第1、2、3、4 周測量小鼠血壓，每次預測試5 次血壓，然后正式測量10 次血壓，并取平均值。

2.1.3 小動物超聲檢測小鼠血管功能 使用異氟烷對小鼠進行吸入式麻醉，將腹部涂好耦合劑的小鼠以仰臥位固定于37 ℃恒溫加熱板上，用小鼠專用超聲探頭獲取主動脈切面圖片。操作時密切關注小鼠心律及呼吸變化，如出現心律過低應立刻停止操作。操作結束后，應用Vevo Strain Software（Vevo LAB 1.7.1）軟件檢測4 組小鼠脈沖波傳播速度和血管壁厚度值。

2.1.4 HE 染色法觀察腹主動脈病理 干預結束后，使用異氟烷麻醉小鼠，進行脫頸處死，冰上采集小鼠腹主動脈，隨后將其置于4%多聚甲醛中固定，然后進行脫水、包埋、切片。用切片機切取4 μm 血管組織置于載玻片上，置于60 ℃烤箱中烘烤1 h 后，進行脫蠟操作，然后用蘇木素染色和伊紅染色，吹干后封片、拍照。

2.2 網絡藥理學靶點預測

2.2.1 異蓮心堿作用靶點收集 使用中藥系統藥理學平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php/）、Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、SymMap（http：//www.symmap.org/）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）獲取異蓮心堿的蛋白靶標，隨后在Uniprot 數據庫（http：//www.Uniprot.org/）中將這些蛋白靶標轉化成基因名并統一，基因設置為人源性的來源［13］，從而獲得異蓮心堿的作用靶點。

2.2.2 異蓮心堿治療高血壓作用靶點收集 在GeneCards 數 據 庫（https：//www.genecards.org/）和DisGeNET 數 據 庫（http：//www.disgenet.org/）中 以“Hypertension”為關鍵詞，檢索出高血壓疾病靶點，去除重復項后，與異蓮心堿的作用靶點相映射，得到異蓮心堿治療高血壓的共同靶點，即作用靶點。

2.2.3 交集靶點互作網絡建立與分析 在STRING數據庫導入異蓮心堿治療高血壓的作用靶點，物種設置為“homo sapiens”，設定置信度＞0.9，其余參數均保持默認設置，獲取相互作用關系的信息表。使用Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制相互作用網絡（PPI）圖，將異蓮心堿治療高血壓的靶點進行可視化分析［14-15］，并確定異蓮心堿治療高血壓的核心靶點。

2.2.4 基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 將“2.2.3”所示核心靶點導入DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行KEGG 富集分析，設置篩選條件為P＜0.005，篩選出KEGG 富集中排名前10 名的通路［14］。

2.3 細胞實驗

2.3.1 細胞培養 用含有胎牛血清的DMEM 培養基培養大鼠胸主動脈平滑肌細胞A7R5，將細胞放置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，鏡下觀察細胞匯合度至70%時，用胰酶消化后傳代，并根據不同實驗目的對細胞進行相應處理。

2.3.2 CCK8 法檢測細胞生長活力 將對數生長期A7R5 細胞按照1.0×104個/孔鋪于96 孔細胞培養板中，培養24 h，根據不同實驗目的，加入不同濃度（0.01、0.1、1、10 μmol/L）的Ang Ⅱ溶液和不同濃度（0.3125、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L）的異蓮心堿溶液，置于培養箱中孵育24 h，避光加入CCK-8 溶液（10 μL/孔），置于培養箱中繼續孵育2 h，應用酶標儀于450 nm 波長下檢測各孔吸光度。

2.3.3 造模與干預 將A7R5 細胞分為對照組、模型組和2.5、5、10 μmol/L 異蓮心堿組，用胰酶消化后計數，以2 mL/孔均勻接種至6 孔板內，培養箱內過夜，待第2 天貼壁后，除對照組外，其余各組加入1 μmol/L 的Ang Ⅱ溶液進行造模刺激，2.5、5、10 μmol/L異蓮心堿組同時分別加入2.5、5、10 μmol/L的異蓮心堿溶液進行干預，各組均干預24 h。

2.3.4 Western blot 檢測A7R5 細胞PCNA、PI3K、p-PI3K、Akt 和p-Akt 蛋白表達量 干預結束后提取蛋白，經電泳、轉模、封閉后，置于p-Akt（1∶1 000）、Akt（1∶1 000）、p-PI3K（1∶1 000）、PI3k（1∶1 000）、PCNA（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）一抗中孵育過夜，TBST 清洗后置于相對應種屬的二抗（1∶5 000）中孵育，TBST 清洗后進行化學發光顯影。

2.4 統計學方法 采用SPSS 25.0 軟件進行數據分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；組內不同時間點比較采用重復測量方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。

4 結 果

4.1 動物實驗結果

4.1.1 4組干預期間血壓指標和體質量比較 與對照組比較，模型組干預1、2、3、4 周的收縮壓、舒張壓和平均動脈壓明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，異蓮心堿組和纈沙坦組干預1、2、3、4 周的收縮壓、舒張壓、平均動脈壓明顯降低（P＜0.05）。4 組小鼠干預1、2、3、4 周的體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 4 組干預期間血壓指標和體質量比較

4.1.2 4 組脈沖波傳播速度和血管壁厚度比較 與對照組比較，模型組脈沖波傳播速度和血管壁厚度均明顯提高（P均＜0.05）；與模型組比較，異蓮心堿組和纈沙坦組脈沖波傳播速度和血管壁厚度均明顯降低（P均＜0.05）。見圖2、圖3。

圖2 4 組主動脈超聲心動圖

圖3 4 組脈沖波傳播速度和血管壁厚度比較

4.1.3 4 組腹主動脈病理形態 與對照組比較，模型組小鼠腹主動脈管壁厚度明顯增厚；而經異蓮心堿和纈沙坦干預后，小鼠腹主動脈管壁增厚程度明顯改善。見圖4。

圖4 4 組腹主動脈HE 染色圖（×40）

4.2 網絡藥理學結果

4.2.1 異蓮心堿潛在靶點與高血壓的作用靶點交集 通過檢索得到異蓮心堿作用靶點105 個，高血壓疾病作用靶點9 317 個，將異蓮心堿作用靶點與高血壓疾病作用靶點相映射，得到90 個共同基因。見圖5。

4.2.2 PPI 網絡圖分析結果 如圖6 所示，PPI 網絡圖中共有45 個節點（即共同作用靶點）74 條節點連接線。將在STRING 數據庫中獲得的PPI 網絡數據導入Cytoscape 3.7.2 軟 件［16］，節 點 平 均 度 值 為3.288 888 889，其中磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α亞型（PIK3CA）、酪氨酸蛋白激酶（LYN）、絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK8）、蛋白激酶Cδ 型（PRKCD）、B 淋巴細胞酪氨酸激酶（BLK）、血小板衍生生長因子受體（PDGFRP）、酪氨酸蛋白激酶（FGR）、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAF1）、酪氨酸蛋白激酶（ABL1）、蛋白激酶C β 型（PRKCB）、血栓素A2 受體（TBXA2R）、酪氨酸蛋白激酶（SYK）、蛋白激酶C θ 型（PRKCQ）、3-磷酸肌醇依賴性蛋白激酶（PDPK1）等14 個節點度值高于平均值，以上節點為異蓮心堿治療高血壓的核心靶點，見圖6。

4.2.3 KEGG 通路富集分析 經篩選得到81 條信號通路，且根據富集通路涉及基因數的大小，由大到小進行排名，篩選出排名前10名的通路，見圖7。

圖7 KEGG 通路富集分析圖

4.3 細胞實驗結果

4.3.1 不同濃度Ang Ⅱ和異蓮心堿對A7R5 細胞活力的影響 與0 μmol/L AngⅡ比較，0.01、0.1、1、10 μmol/L AngⅡ干預A7R5 細胞后細胞活力明顯提高（P＜0.05）；與0 μmol/L 異蓮心堿比較，20、40、80 μmol/L異蓮心堿干預A7R5細胞后細胞活力明顯降低（P＜0.05）。因此，本研究選擇2.5、5、10 μmol/L的異蓮心堿和1 μmol/L 的Ang Ⅱ進行后續實驗。見圖8。

圖8 不同濃度AngⅡ和異蓮心堿對A7R5 細胞活力的影響

4.3.2 5 組A7R5 細胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 和PCNA 蛋白表達量比較 與對照組比較，模型組PCNA蛋白表達量和p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值均明顯提高（P＜0.05）；與模型組比較，10 μmol/L 異蓮心堿組PCNA 蛋白表達量和p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值均明顯降低（P＜0.05）。見圖9。

圖9 5 組A7R5 細胞p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt 和PCNA 蛋白表達量比較

5 討 論

高血壓屬中醫學“頭痛”“眩暈”的范疇［17］，其核心病機為肝陽上亢，治療以清心火、瀉肝火為主［18］。有研究顯示，Ang Ⅱ對血管結構和功能具有重要影響［19］，在高血壓情況下，Ang Ⅱ會大量釋放，使血管中膜的血管平滑肌細胞發生由收縮性向合成型演變的表型轉換，發生合成型轉變的血管平滑肌細胞在血管中膜異常增殖，導致血管壁增厚，血管腔隙變窄，又進一步加重高血壓［20］，成為惡性循環。因此，尋找抑制血管平滑肌增殖的潛在機制是治療高血壓的思路之一。動物實驗結果表明，異蓮心堿可以明顯降低高血壓模型小鼠的收縮壓、舒張壓和平均動脈壓，改善高血壓小鼠的血管功能，促進血管壁增厚。

進一步利用網絡藥理學篩選出異蓮心堿和高血壓的疾病共同靶點90 個，其中排名第1 的靶點是PIK3CA，在排名前10 的信號通路中，也富集到了PI3K/Akt 信號通路，提示PI3K 及其下游的Akt 通路可能是異蓮心堿調控高血壓的途徑之一。在這條通路中，包含PIK3CA［21-22］、SYK［23］、CDK2［24］等多個與增殖相關的靶點，這些靶點與PCNA 關系密切，如PCNA 能夠與Cyclin A-CDK2 形成復合物，并連接CDK2 及其下游的通路［25］，發揮促增殖的作用。因此，PCNA 作為DNA 聚合酶δ 和ε 的輔助因子［26］，可以評價細胞增殖情況［27］，其表達水平的高低可以反映血管平滑肌的增殖活性［28-29］。研究發現，受Ang Ⅱ刺激后，PI3K 被激活發生磷酸化［30］，活化的PI3K 會使磷脂酰肌醇2（PIP2）轉化為磷脂酰肌醇3（PIP3）［31］，從而調節包括細胞增殖在內的多種胞內活動［32］；同時，當細胞信號傳導至Akt，Akt 也會在Ser473 位點發生磷酸化并激活下游的靶標蛋白［33-34］，發揮促進細胞生長、增殖和凋亡的作用［35］。

體外實驗發現，異蓮心堿能夠降低Ang Ⅱ刺激后血管平滑肌細胞中PCNA、p-PI3K、p-Akt 的表達，并抑制PI3K/Akt 通路的激活，進一步提示異蓮心堿可能通過調節PI3K/Akt 途徑及PCNA 的表達改善平滑肌增殖來治療高血壓。但本研究對于機制的探討僅停留在蛋白層面，后續研究會從基因水平更深入地探討異蓮心堿調控高血壓導致的血管平滑肌的具體機制。

綜上，異蓮心堿調控高血壓具有多靶點、多途徑的獨特優勢，異蓮心堿可能通過PI3K/Akt 通路改善血管平滑肌細胞增殖治療高血壓。