合成大麻素及其代謝物的檢測方法研究進展

宗興森，何丹丹，王媛媛，柯 星，范一雷

(1.浙江警察學院 浙江省毒品防控技術研究重點實驗室，浙江 杭州 310051；2.浙江工業大學 化工學院，浙江 杭州 310012)

1 合成大麻素的發展歷史及現狀

近10年，全世界地下非法市場上出現大量的新精神活性藥物，這些藥物大多被不法分子濫用于“娛樂”消遣。為規避當地政府的法律，地下非法藥物制造者大多采用科學文獻報告和大型醫藥公司合成的精神活性物質，通過化學結構的略微修飾，生產出新的精神活性化合物。在化學類別中，被稱為“合成大麻素”的合成大麻素受體調節劑一直處于最前沿[1]。合成大麻素是一類對人體作用機理與天然大麻素四氫大麻酚(THC)相似的新精神性物質，主要通過和人體內的大麻素受體CB1和CB2結合而發揮作用結合。相比于天然大麻素，合成大麻素在人體內發揮的藥效作用更強，對人體的危害更大[2]。合成大麻素的藥效作用是通過與細胞膜的特異性相互結合而產生的[3]。在 1980 年，大麻素受體經過鑒定，用 CB 縮寫來表示，并根據發現的順序分別編號為 CB1、CB2[4]。CB1、CB2都是G蛋白偶聯受體家族[5]，它們之間的區別主要在氨基酸序列、信號傳導機制和組織分布等方面[6]。絕大多數的CB1受體在中樞神經系統(Cns)中表達[7]，在某些情況下，也存在于神經元的樹突和胞體上[8]。大麻素可能通過表達CB1受體的偶聯和細胞類型來調節不同的細胞功能[9]。在神經元胞體上表達的CB1受體的激活增加Erk活性，并誘導腦源性神經營養因子(BDNF)表達。大麻素類化合物的神經保護作用，可能部分是通過這一機制介導的[10]。小鼠實驗證明，與CB2受體結合的大麻素，導致免疫應答的變化，特別是在巨噬細胞誘導的輔助T細胞活化水平上[11]。新合成的大麻素類化合物繼續出現在市場上，而這些新化合物大多是作用于CB1受體。研究表明，大麻素可以抑制多種神經遞質的釋放：當CB1受體被大麻素激活后，經過G蛋白傳導，抑制腺苷酸環化酶，使cAMP含量減少，進而抑制了cAMP依賴的蛋白激酶，蛋白激酶被抑制后使外向性K+流興奮；同時，CB1受體還與Ca2+通道偶聯，大麻素作用后，使Ca2+內流減少，進而使突觸前膜神經元內神經遞質釋放減少，最后影響突觸后膜分別產生興奮性或抑制性作用[12]。

從1960 年開始，已經開始出現Δ9-THC 的類似物，如HU-210、大麻隆、屈大麻酚等。10 年后，Pfizer[13-14]開發了環己基苯酚(CP)系列的化合物，樣品包括合成大麻素CP-59、CP-47和它們的n-烷基同系物。1994 年，美國化學家 Huffman等[3]研制了以萘甲?；胚犷悶橹鞯南盗谢衔铮饕ㄝ良谆胚犷?、萘甲?；量╊悺⑤良谆犷惡捅揭阴＿胚犷惖?，即最早的合成大麻素。后來被命名為 JWH 系列化合物，包括 JWH-018、JWH-073 和 JWH-200等。合成大麻素從萘甲酰吲哚開始(JWH-018)，逐漸發展為萘甲?；?THJ)，然后為吲唑(AKB-48)，直至吲哚甲酰胺(MDMB-CHMINACA)[15]。根據合成大麻素出現的時間，可以簡單的將合成大麻素分成兩代，JWH-018、JWH-250屬于第一代，AM-2201屬于第二代[16]。從結構上來說，很多合成大麻素與經典大麻素無關。按照結構來分，合成大麻素大致可分為七類，即：萘甲?；胚犷?JWH-018)、萘甲基吲哚類、萘甲酰基吡咯類、萘甲基茚類、苯乙?；胚犷?JWH-250)、環乙基苯酚類(CP47，497)和傳統大麻素[17]。多數傳統的大麻素類化合物，是以部分還原的二苯吡喃結構為基礎合成的[18]。合成大麻素的主體結構見圖1。

圖1 合成大麻素的主體結構

主體結構包含一個雜環核心結構、一個取代基、一個連接雜環核心結構和取代基的基團和一個側鏈。雜環核心結構一般為吲哚、吲唑、2-甲基吲哚結構等；取代基主要是親脂性取代基，包括萘基、氨基酸衍生物等；連接基團一般為酰胺基、羰基等；側鏈主要是親脂側鏈，如戊基、氟化戊基、對氟芐基等。大部分合成大麻素的結構都是由主體部分發展而來的。

每年都有數十種新的精神活性物質出現在歐洲的毒品市場上。這些化合物中最豐富的是合成大麻素。最初幾年，在吸毒人群中，JWH化合物尤其流行。然而，隨著新化合物的產生，合成大麻素的基團也不斷增加[19]。2012年，在美國運動員的血液樣本中發現JWH-018和JWH-073；2014年，在因受影響駕駛而被罰款的人的血液樣本中，檢出多種合成大麻素，包括AM-2201和JWH-018[20]；2014年，在俄羅斯，MDMB-FUBINACA引起了60多起的中毒事件，其中包括15人死亡。2015 年，波蘭大規模爆發了幾百起中毒事件，包括至少3起致命事件，均由使用一種名為“運動員”的新型精神活性物質產品造成。這種產品中含有合成大麻素混合物，其中還有MDMB-CHMICA[21]。對于大多數合成大麻素類化合物，我們了解的藥理學和毒理學知識不多，但這些化合物會對人類健康造成嚴重危害是必然的。

在2000年，合成大麻素第一次以草藥的形式在市面上出現，并作為一種新型的精神活性物質在全球的范圍內有著非常廣泛的使用。在2008年以前，在“娛樂”毒品市場上很少或根本沒有觀察到合成大麻素類藥物，但目前它們已成為“娛樂”性精神活性物質中應用最廣泛的一類，占設計藥物市場的28%，超過合成卡西酮(25%)或色胺致幻劑(4%)[22]。自2008年以來，新的精神活性物質的數量迅速增加[23 ]，2014年達到101種。自2015年以來，新物質的數量略有減少，但是仍處于較高水平[24 ]。“香料(Spice)”毒品是一類添加合成大麻素的植物制品，制毒者通常將合成大麻素用有機溶劑溶解，噴涂于香料或藥草上并加入添加劑，晾干后即制得成品。這類毒品在國外最早出現于 2006 年，2008 年開始流行[25]。最近幾年，隨著對新型香料產品研究的深入，以及對潛在健康問題的關注，世界上不少國家都采取了立法行動來禁止或者用別的方式來管制“香料”產品和其相關的化合物。在中國，除了2013年對第12個物質的第一次管制外，2015年10月1日對116種非醫療用麻醉藥品和精神藥物進行了控制，其中包括40種合成大麻素。世界衛生組織估計，2013年，年齡在15～64歲之間的1.818億人使用大麻用于非醫療用途(世界衛生組織，2016年)。聯合國毒品和犯罪問題辦公室2015年的世界毒品報告指出，合成大麻素占所有新型精神活性物質的39%(美國，2016年)[26]。2016年7月之后，又增加22種合成大麻素。如AB-CHMINACA和MAB-CHIMINACA，UR-144和XLR-11，PB-22和5F-PB-22[27]。目前，已有600多種合成大麻素已被報道[28]。

2 合成大麻素的檢測

合成大麻素的種類較多，不同種類的合成大麻素結構相差較大；這給合成大麻素的檢測帶來了一定的難度。近幾年，我國對合成大麻素的分析主要是對“香料”產品中主要成分的檢測以及對新型成分的結構鑒定[29]。目前，對合成大麻素類藥物的檢測分析主要有以下幾種：薄層色譜法、核磁共振(NMR)和紅外光譜分析法(IR)、色質聯用技術(包括氣質聯用(GC-MS)和液質聯用(LC-MS))。

薄層色譜法是一種簡單快速的檢測方法，目前有關于薄層色譜法檢測合成大麻素的報道相對較少。在很多實驗室中，GC和HPLC已經代替了這種方法，但是對于安非他明、天然大麻素、阿片類藥等濫用藥物，薄層色譜法仍然在使用[30]。Logan等[31]人在2012年曾用薄層色譜法檢測美國草本香料混合物中的合成大麻素，結合GC-MS等其他檢測分析方法，最終測定了JWH-018、JWH-019、JWH-073、JWH-081、JWH-200、JWH-210、JWH-250、49RCS-4、RCS-8，AM-2201和AM-694等各種合成大麻素，還發現了其他非大麻素類藥物。

NMR和 IR對 LC-MS 和 GC-MS 中的未知峰有很重要的補充作用。Ji Hyun等[32]人對吲唑-3-甲酰胺類合成大麻素進行鑒定和表征，以DMSO-d6為溶劑進行NMR實驗，通過NMR和IR實驗，進一步確定DMBA-CHMINACA為MDMB-CHMINACA的水解形式，并確定了DMBA-CHMINACA的結構。2012年，Simolka等[33]人對德國市場上的七種商業“香料”產品進行了分析，它們都含有大量的合成大麻素，實驗通過核磁共振波譜確定所有化合物的結構，并進一步用紫外、質譜等方法對其進行了表征。

GC-MS是一種常用的分離技術，在大多數實驗室中，被用于鑒別和定量檢測生物樣品中的藥物成分[34]。然而，GC-MS也有一些不足之處，如高保留率和對分析物質量的限制，且不適用于一些熱不穩定的化合物，所以在對某些化合物前處理時通常需要進行衍生化處理。Akira等[35]人總結了關于草藥中合成大麻素的GC-MS檢測方法：將草藥樣品放入頂空小瓶，蓋上聚四氟乙烯/硅酮隔板；樣品在 200 ℃ 下孵育，脈沖攪拌轉速為 250 r/min；將羧基/聚二甲基硅氧烷纖維插入頂空 5 min 進行萃?。蝗缓髮⒗w維注入氣相色譜入口 15 min，解吸分析物；最后得到合成大麻素在樣品中的LOD值至少為 20 μg。Ojanpera[36]采用GC-APCI-QTOFMS鑒別血液中的新型精神活性物質，對綿陽血中的5中精神活性進行了分析鑒定。

國內對合成大麻素的檢測一般較多采用高效液相色譜法，而LC-MS /MS具有靈敏度高，準確度高等優勢，且相比較液相色譜而言具有分析時間短等優點。2014年，張春水等[37]人檢測常見10種合成大麻素的高效液相色譜-三重四極桿質譜(HPLC-MS /MS)定性、定量分析方法，并依據質譜特征推測了其碎裂途徑。

3 對合成大麻素代謝物的研究

大多數的合成大麻素都具有親脂性，并且在人體中快速代謝，在常規的生物樣品中很難檢測到母體藥物，所以找到和合成大麻素的生物標記物就至關重要。對合成大麻素代謝物的研究主要分為體內代謝和體外代謝，體外代謝方法主要有人肝細胞培養和肝微粒體孵育實驗。體內代謝主要有大鼠模型和斑馬魚模型。 Wohlfarth等[38]人通過實驗比較了體內、體外代謝的優缺點。對于體內代謝，主要的檢測途徑有尿液中代謝物的檢測和血漿中代謝物的檢測。而對于體內實驗獲得的樣品要進行前處理，通常使用的前處理方法有液液萃取、固相萃取等。Per Ole M[39]用UHPLC-QTOF-MS對尿液中合成大麻素代謝物進行定量，進樣之前對樣品進行前處理，采用的前處理方法為固相萃取，比較了不同的固相萃取柱最終選擇了HLB固相萃取柱，HLB固相由親水性和親脂性相結合而成，該吸附劑不需要調節和平衡步驟，且回收率較高。GC-MS和LC-MS是檢測合成大麻素最常用的儀器。GC-MS由于其極性高、揮發性低，在檢測合成大麻素代謝物方面有其局限性。相比之下，LC-MS是分析非揮發性化合物、極性化合物、熱不穩定化合物和大分子化合物的首選儀器。

現在購買得到的人肝細胞保留了大多數Ⅰ相和Ⅱ相酶的活性，通過實驗可得到高質量的代謝數據，但是人肝細胞價格比肝微粒體昂貴的多，且一旦解凍必須充分利用，不可再次冷凍。Karl[40]通過FUBIMINA在人肝細胞中的代謝來識別FUBIMINA與其異構體THJ-2201；為了區分FUBIMINA和THJ-2201，實驗通過采用相同的采集和處理方法對同一程序孵育的THJ-2201肝細胞樣本進行了分析。在人肝細胞中孵育FUBIMINA異構體，通過HPLC-HR-MS分析孵育樣品，表征獨特的主要代謝物保留時間和碎片分布，并與病例尿液樣本進行比較。Diao[41]通過高分辨質譜研究EG-018在人肝細胞中的代謝情況，找到適宜的尿標志物代謝物記錄EG-018的消耗情況，并用Compound Discoverer軟件對其原始數據進行分析處理。

HLM體外孵育實驗具有操作簡單，成本低等優點，但該實驗不能定量的估計體內的生物轉化，Lukas等[42]人通過人肝微粒體體外實驗孵育CUMYL-PEGACLONE，檢測其Ⅰ相代謝物以及對30份真實尿液樣本進行了檢測，尿液用ACN和NH4+HCOO-進行液液萃取；CUMYL-PEGACLONE是一種新型的合成大麻素；實驗通過采用液相色譜串聯質譜和液相色譜串聯高分辨質譜技術在體內檢測到這種新物質的Ⅰ期代謝產物。最終共檢測到22種不同的Ⅰ期代謝產物，其中包括羥基化、脫氫等常見的代謝方式。Claudio等[43]人研究了合成大麻素AB-CHMINACA的體外和體內人體代謝，體外代謝研究為體外肝微粒體孵育實驗，體內實驗則用一名AB-CHMINACA使用者的尿液，50 μL 尿液用 150 μL 乙腈稀釋乙腈并渦旋30秒。然后將樣品用 10000 r/min 的轉速旋轉，持續 2 min。 然后將上清液轉移到用于分析的進樣小瓶。采用液相色譜-飛行時間質譜聯用技術對AB-CHMINACA代謝產物的形成進行監測，檢測到26種AB-CHMINACA的代謝產物，包括7種單羥基化代謝物和6種二羥基化代謝物，以及AB-CHMINACA脫烷基化產物，全部由細胞色素P450(CYP)酶產生，兩種羧化代謝物，可能由酰胺酶產生；其中羥基化和羧化可能為其主要的代謝方式。Shimpei[44]研究了高效液相色譜-高分辨質譜聯用測定用人肝微粒體孵育合成大麻素AM 1220的體外代謝，并將實驗所得數據與文獻中人體的數據進行比較。Ariane Wohlfarth等[45]人研究研究了戊環吲哚/戊環咪唑合成大麻素AB-PINACA和5F-AB-PINACA的代謝產物。

大鼠體內實驗容易操作，動物的血漿和尿液的收集相對容易，但是大鼠代謝模型相較于人體代謝來說還是存在物種差異。APINAC是一種新型的合成大麻素；Jungjoong等[46]人采用大鼠模型，研究了APINAC在體內和體外的代謝，體外采用鼠肝微粒體模型，體內實驗給大鼠靜脈注射APINAC 5 mg/kg，特定的時間點采集血樣，并且在給藥一天內采集尿樣，然后由液相色譜串聯高分辨質譜和液相串聯低分辨質譜進行檢測?？偣苍赗LMS和大鼠尿液中可檢出22種APINAC代謝產物。APINAC主要通過酯水解生成羧酸，是APINAC攝入的典型標志。Sabina等[47]人研究了四種合成大麻素的代謝反應，使用MetaSite軟件自動分配代謝物結構來執行代謝物的鑒定，使用MetaSite軟件進行的計算機代謝預測顯示了實驗和計算機數據之間的良好一致性。

斑馬魚生長迅速，且斑馬魚與人類基因組同源性高[48]，可產生與人體相似的Ⅰ相氧化和還原代謝物。但目前為止，國內外做合成大麻素斑馬魚代謝實驗的較少。 Xu等[49]人采用人肝微粒體和斑馬魚模型研究了新的非法藥物AMB-FUBINACA的代謝特征。

4 結語

本文對合成大麻素的發展歷史和現狀進行了介紹，總結了合成大麻素的檢測方法及其代謝物的研究方法，列舉了近幾年來對合成大麻素及其代謝物的研究一些常見的檢測方法和研究手段，為能建立一個能快速、準確檢測合成大麻素及其代謝物的新方法奠定基礎，為進一步研究合成大麻素代謝物的結構給予方法指導。