高效液相法測定海洋硅藻中5種葉黃素類化合物*

汪麗婷，朱軍旺，肖 玉，周成旭，張金榮

(寧波大學(xué) 食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315832)

海洋硅藻是一類重要的海洋生物，其作為海洋生態(tài)環(huán)境最主要的初級(jí)生產(chǎn)者，參與到海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量循環(huán)，對(duì)維持海洋生態(tài)系統(tǒng)具有重要的作用[1-2]。海洋硅藻具有多種功能，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)、工業(yè)廢水綜合利用以及高價(jià)值商業(yè)產(chǎn)品可持續(xù)生產(chǎn)[3-4]。它具有光合效率高、可規(guī)模化培養(yǎng)、并且培養(yǎng)不受季節(jié)影響、不占用耕地的優(yōu)勢[5-6]。特別值得關(guān)注的是，海洋硅藻富含多種有益健康的活性成分，包括葉黃素類、多糖、蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸等，具有巨大開發(fā)潛力，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、水產(chǎn)養(yǎng)殖等多個(gè)領(lǐng)域[7-8]。而且，它能產(chǎn)生特定的高價(jià)值化合物[9-10]。因此，近幾十年來，硅藻的種質(zhì)創(chuàng)新、培養(yǎng)模式和條件的優(yōu)化，及硅藻中高值化成分的生物精煉均已獲得了極大的關(guān)注[11-14]。

海洋硅藻中含有多種葉黃素類成分，包括新黃素、玉米黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素等[15-16]，其中，巖藻黃素是自然界中最豐富的葉黃素類成分，約占所有類胡蘿卜總產(chǎn)量的10%[17]，硅甲藻黃素、硅藻黃素是海洋硅藻的特征色素[18]，新黃素和玉米黃素廣泛存在于海洋浮游藻類中[19]，這5種葉黃素類成分均具有多種生物活性[20-23]。

高效液相色譜法具有分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性高、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于合成化學(xué)、生命科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、食品檢驗(yàn)等領(lǐng)域[24-25]。為了評(píng)估海洋環(huán)境中浮游藻類組成和物種多樣性，Jayaraman等采用高效液相色譜法可一次運(yùn)行達(dá)到有效分析60多種成分，實(shí)現(xiàn)了多組分的同時(shí)定量測定[26]，但該測定方法需要過多的標(biāo)準(zhǔn)品。為了明確銅藻的漂浮生長機(jī)制，張恒等采用液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)比較分析了不同來源銅藻中10種色素種類及分布規(guī)律[27]。為了比較不同海洋微藻之間色素組成及分布情況，鄭立洋等采用液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)測定了海洋微藻中葉綠素a、葉綠素b、β，β-胡蘿卜素、葉黃素和巖藻黃素的含量[28]。然而，液質(zhì)聯(lián)用分析技術(shù)需要使用的設(shè)備昂貴、分析成本高、操作復(fù)雜[29]。因此，針對(duì)海洋硅藻中葉黃素類成分，需要建立一種簡便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高的分析方法，為硅藻高值化利用的藻種篩選和生物精煉提供條件。現(xiàn)已發(fā)展多種用于HPLC分離的色譜柱，其中，反相色譜柱是以鍵合非極性基團(tuán)的載體為填充劑的色譜柱，最常用的填充劑有十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)，C18有較高的碳含量和較好的疏水性，適用于大多數(shù)化合物的分析，具有分離度高、重現(xiàn)性好、使用壽命長等優(yōu)點(diǎn)，已在各國藥典中廣泛應(yīng)用于大多數(shù)藥品的分析測定[30-31]。為實(shí)現(xiàn)硅藻中葉黃素類組分高值化利用過程的表征及藻種的定性篩選，本文采用C18色譜柱作為固定相，建立了不同海洋硅藻中5種葉黃素類化合物(包括新黃素、硅藻黃素、硅甲藻黃素、玉米黃素及巖藻黃素)的定量分析方法，并利用該方法比較了8種海洋硅藻之間5種葉黃素類化合物的分布情況。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters 2695高效液相色譜儀(配備PDA檢測器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器以及Empower數(shù)據(jù)處理系統(tǒng))，美國Waters公司；Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國Agilent公司；Scientz-10N普通型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；GL-21M高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素、玉米黃素、新黃素5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品純度均高于95%，美國Sigma-Aldrich有限公司；0.22 μm 聚四氟乙烯(PTFE)濾膜針筒過濾器、乙腈(色譜級(jí))均購置于上海安譜科技股份有限公司；丙酮，分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制：分別精確稱取新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素各 1.0 mg，分別置于 10 mL 棕色容量瓶中，用適量丙酮溶解、稀釋并定容至 10 mL，分別配制成5種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，質(zhì)量濃度均為 100 mg/L，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用錫箔紙包裹置于 -20 ℃ 冰箱中避光保存。

新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確吸取5種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制得到質(zhì)量濃度均為 20 mg/L 的5種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液的配制：分別準(zhǔn)確吸取適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用丙酮稀釋得到混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，質(zhì)量濃度分別為：0.1、0.2、0.5、0.75、1.0、2.0、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0 mg/L 。

1.3 藻株培養(yǎng)和生物質(zhì)收集

表1所示的8株海洋硅藻均由寧波大學(xué)浙江省海洋生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室微藻種質(zhì)庫提供。用于海洋硅藻培養(yǎng)的海水均經(jīng)脫脂棉過濾、煮沸消毒，所有容器均需高溫滅菌。本實(shí)驗(yàn)選取的8株海洋硅藻均采用f/2培養(yǎng)基，在逐級(jí)擴(kuò)大預(yù)培養(yǎng)基礎(chǔ)上，將生長至指數(shù)期的海洋硅藻接藻種在 5000 mL 錐形瓶中進(jìn)行定量培養(yǎng)，水體總體積 3000 mL，各3組平行。在溫度為(23±1)℃、光照強(qiáng)度 50 μmol/(m2·s)，光照周期為L∶D=12 h∶12 h 的條件下培養(yǎng) 8 d，每天人工搖瓶2次。從接種硅藻第一天開始，每隔一日取樣用血球計(jì)數(shù)板檢測藻細(xì)胞數(shù)。8種硅藻均在平臺(tái)期收獲，藻液在 4 ℃，8000×g離心 20 min，棄去上清液，獲取硅藻細(xì)胞，將硅藻細(xì)胞冷凍干燥 48 h，獲得凍干藻粉。凍干藻粉用鋁箔包裹，于 -20 ℃ 冰箱中冷凍保存。凍干藻粉需在一個(gè)月內(nèi)進(jìn)行葉黃素類成分提取及分析。

表1 實(shí)驗(yàn)用海洋硅藻藻株種名及庫存編號(hào)

1.4 海洋硅藻中葉黃素類成分的提取

海洋硅藻中葉黃素類成分的提取參照鄭立洋等[28]的方法，略加修改。海洋硅藻在指數(shù)生長期末尾收獲約 3000 mL 藻種培養(yǎng)液，準(zhǔn)確稱量制備得到的硅藻凍干藻粉的質(zhì)量，計(jì)算每 100 mL 海洋硅藻培養(yǎng)液應(yīng)制得的凍干藻粉質(zhì)量并準(zhǔn)確稱取，放入 5 mL 具塞刻度試管中，加入 2.7 mL 冷丙酮，在冰水中超聲 2 min，再加入 0.3 mL 的去離子水，使丙酮最終含量為90%，將具塞刻度試管置于 -20 ℃ 冰箱中靜置過夜。海洋硅藻提取液在12000×g離心 10 min，取上清液經(jīng) 0.22 μm 濾膜針式濾器過濾，取續(xù)濾液進(jìn)行HPLC分析。為了避免提取過程中葉黃素類組分降解，以上實(shí)驗(yàn)均在暗室的冰盒中進(jìn)行，且處理得到的樣品應(yīng)在 48 h 內(nèi)進(jìn)行HPLC分析。

1.5 HPLC色譜分析條件

采用高效液相色譜(HPLC)法對(duì)海洋硅藻提取物進(jìn)行分離，用巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素、玉米黃素、新黃素等5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品作為參照物進(jìn)行指標(biāo)成分峰的定位。HPLC分析條件如下：使用安捷倫Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，粒徑 5 μm)，進(jìn)樣量為 10 μL，柱溫為 25 ℃；流動(dòng)相為乙腈(A)和純水(B)，流速為 2.0 mL/min，檢測波長為 450 nm。線性梯度洗脫程序見表2。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2 結(jié)果與討論

2.1 方法驗(yàn)證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限(LOD)和定量限(LOQ)

取新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，按照1.5節(jié)的HPLC色譜條件進(jìn)行分析。由表3可知，新黃素、巖藻黃素和硅甲藻黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.2～20 mg/L；硅藻黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為2.0～20 mg/L；玉米黃素的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為5.0～20 mg/L，5種葉黃素類成分在以上質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2均高于0.999。

表3 五種葉黃素類成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限和定量限

取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，采用逐級(jí)稀釋的方法進(jìn)行稀釋并進(jìn)行HPLC檢測，以信噪比(S/N)≥ 3為檢測限(LOD)。由表3可知，新黃素、巖藻黃素和硅甲藻黃素的檢測限均為 0.06 mg/L，硅藻黃素的檢測限為 0.66 mg/L，玉米黃素的檢測限為 1.00 mg/L；以信噪比(S/N)≥ 10為定量限(LOQ)，新黃素、巖藻黃素和硅甲藻黃素的定量限均為 0.20 mg/L，硅藻黃素的定量限為 2.00 mg/L，玉米黃素的定量限為 3.00 mg/L。

5個(gè)葉黃素類成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 mg/L)的HPLC色譜圖見圖1。由圖1可知，新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素的保留時(shí)間分別為7.2、8.6、14.7、21.7、25.3 min，出峰時(shí)間合適，峰形良好，建立的方法對(duì)5種葉黃素類成分均具有良好的分離效果，表明該方法專屬性良好。

1.新黃素；2.巖藻黃素；3.硅甲藻黃素；4.硅藻黃素；5.玉米黃素。圖1 5種葉黃素類成分混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 mg/L)的HPLC色譜圖

2.1.2 方法的精密度和回收率

選取低、中、高3個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC測定，計(jì)算方法的日內(nèi)精密度。每個(gè)樣品在一天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄5種葉黃素類成分的峰面積及保留時(shí)間，分別計(jì)算相應(yīng)的峰面積和保留時(shí)間的日內(nèi)精密度，測定結(jié)果見表4。由表4可知，5種葉黃素類成分峰面積的日內(nèi)RSD為0.33%～3.56%，保留時(shí)間的日內(nèi)RSD為0.13%～0.68%。

表4 五種葉黃素類成分的峰面積和保留時(shí)間的日內(nèi)、日間測定精密度

選取低、中、高3個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC測定，每天連續(xù)進(jìn)樣測定5次，連續(xù)5天，記錄5種葉黃素類成分的峰面積及保留時(shí)間，分別計(jì)算相應(yīng)的峰面積和保留時(shí)間的日間精密度，測定結(jié)果見表4。由結(jié)果可知，5種葉黃素類成分峰面積的日間RSD為1.07%～4.97%，保留時(shí)間的日間RSD為0.13%～1.15%。

經(jīng)分析可知，新黃素、巖藻黃素、硅甲藻黃素、硅藻黃素和玉米黃素的峰面積和保留時(shí)間的日內(nèi)、日間精密度RSD值均小于5%，說明本方法精密度良好。

準(zhǔn)確稱取相同質(zhì)量的梅尼小環(huán)藻(NMBguh026-8)樣品2份，其中1份加入已知量的含有5種葉黃素類成分的混標(biāo)，另1份不加，2份樣品均采用1.4節(jié)所示方法提取樣品中葉黃素類化合物。兩份樣品均按照1.5節(jié)的HPLC色譜條件測定5次。根據(jù)加標(biāo)樣品測出量減去未加標(biāo)樣品測出量再除以標(biāo)準(zhǔn)加入量計(jì)算各組分的回收率，并根據(jù)5次平行測定的結(jié)果計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表5。

表5 5種葉黃素類化合物的回收率

由表5可知，5種葉黃素類成分的回收率均在88.40%～115.00%，且RSD均低于5.0%。表明該方法能較好地滿足硅藻中葉黃素類化合物的分析要求。

2.2 樣品測定

海洋硅藻藻株收獲時(shí)，充分搖勻藻液，分別取1mL藻液，用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下進(jìn)行藻細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果表明，三角褐指藻(NMBguh001)、角毛藻(NMBguh003-3)、角毛藻(NMBguh003-11)、角毛藻(NMBguh003-17)、中肋骨條藻(NMBguh004-2)、舟形藻(NMBguh006-6)、雙眉藻(NMBguh007)和梅尼小環(huán)藻(NMBguh026-8)的藻密度分別為5.85×105、4.50×105、4.65×105、6.00×105、8.03×105、3.00×105、2.33×105、1.05×105mL-1。按照1.4節(jié)建立的方法對(duì)每個(gè)藻株進(jìn)行處理，每個(gè)樣品平行上機(jī)檢測3次，測定結(jié)果如表6所示。

表6 各種硅藻中5種葉黃素類成分含量

由表6可知，巖藻黃素和硅甲藻黃素存在于所有檢測的硅藻藻株中。其中，巖藻黃素含量在梅尼小環(huán)藻(NMBguh026-8)中最高(8.45×10-2ng/個(gè))，在中肋骨條藻(NMBguh004-2)中最低(8.6×10-3ng/個(gè))；硅甲藻黃素含量在雙眉藻中含量最高(3.82×10-2ng/個(gè))，在中肋骨條藻(NMBguh004-2)中最低(7.00×10-4ng/個(gè))。硅藻黃素存在于6種檢測的硅藻藻株，包括梅尼小環(huán)藻(NMBguh026-8)、角毛藻(NMBguh003-3)、角毛藻(NMBguh003-17)、角毛藻(NMBguh003-11)、舟形藻(NMBguh006-6)和雙眉藻(NMBguh007)。其中，硅藻黃素在梅尼小環(huán)藻(NMBguh026-8)中含量最高(4.56×10-2ng/個(gè))，在角毛藻(NMBguh003-11)中含量最低(4.00×10-4ng/個(gè))。新黃素和玉米黃素在所有檢測的硅藻藻株中均未檢測出來。

本方法可對(duì)海洋硅藻同時(shí)測定分析5種葉黃素類化合物，具有靈敏度高，效率高，操作方便的優(yōu)點(diǎn)，為今后的硅藻中葉黃素類組分的分析提供了簡便的測定方法。

3 結(jié)論

本文建立了運(yùn)用高效液相法同時(shí)測定海洋硅藻中5種葉黃素類化合物的方法，并進(jìn)行了方法有效性驗(yàn)證，包括方法的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)、檢測限、定量限、日內(nèi)精密度、日間精密度和回收率等。采用該方法測定分析了8種海洋硅藻中5種葉黃素類化合物的分布情況，發(fā)現(xiàn)巖藻黃素和硅甲藻黃素存在于所有檢測的硅藻藻株中，硅藻黃素存在于6種檢測的硅藻藻株中，新黃素和玉米黃素在所有檢測的硅藻藻株中均未檢測出來。該方法具有前處理過程簡單、分析靈敏高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，有效避免了葉黃素類組分在長時(shí)間、復(fù)雜的前處理及分析檢測過程中的損失，提高了葉黃素類組分檢測的效率以及準(zhǔn)確性。本方法可為硅藻中多種葉黃素類化合物的同時(shí)測定提供技術(shù)支持，為今后利用葉黃素類組分含量進(jìn)行藻種優(yōu)選、培養(yǎng)條件優(yōu)化、制備技術(shù)開發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)分析手段。