白藜蘆醇對花生油熱致異構反式脂肪酸的抑制作用

李 甜，郭 芹，屈 陽，梁蔓竹，張巧真，秦晶晶，黃雪港，張 雨，王 強,*

（1.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193；2.中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

我國花生品種資源豐富、種植廣泛，2021年我國花生種植面積達7 125萬 畝，主要分布在河南、山東、河北、廣東、遼寧、四川、湖北等省[1]。其中一半以上花生都用作榨油（55.77%），2021年我國花生油產量和消費量分別達到了324.8萬 t和345.8萬 t，分別占全球的50.2%和49.4%，均居世界首位[2]。花生油組成98%以上為甘油三酯，另外還含有微量的甘油二酯和甘油一酯等。甘油三酯是甘油和3 個脂肪酸酯化形成，花生油中脂肪酸主要為油酸（O）和亞油酸（L），因此其甘油三酯主要由OOL（14.7%）、OOO（13.6%）和OLL（12.2%）組成[3]。新鮮壓榨的花生油中甘油三酯鏈上不飽和脂肪酸的雙鍵都為順式結構，由于雙鍵不穩定，在加工貯藏過程中容易發生異構反應生成反式結構，即反式脂肪酸[4]。

花生油中的反式脂肪酸有害人體健康，攝入過多易引起心血管疾病[5]、癌癥[6]、炎癥反應[6]、損害記憶力[7]等。據研究報道，人體每增加2%反式脂肪酸攝入量，患冠心病風險增加23%[8]。反式脂肪酸的危害也已引起了國際社會的關注，2018年5月14日世界衛生組織發布了名為“取代”的行動指導方案，計劃在2023年之前徹底清除全球食品供應鏈中使用的人造反式脂肪[9]。世界各國也出臺了相關政策限制食品中反式脂肪酸的含量[10]，美國禁止在食品中使用反式脂肪[11]，日本等國家要求必須有包裝標識，我國也規定嬰幼兒配方食品中反式脂肪酸低于脂肪的3%[12]。因此，抑制花生油中反式脂肪酸的形成刻不容緩且至關重要。

目前抑制油中反式脂肪酸形成主要通過以下3 種途徑，包括提高制油技術、優化工藝參數、添加抗氧化劑等。提高制油技術是指在傳統常規工藝方法（高溫壓榨法、低溫物理壓榨法、浸出法、水酶法等）的基礎上，選擇新型綠色制備方法（亞臨界萃取法、超臨界CO2萃取法[13]等）和組合制備方法（高溫壓榨-浸出法、低溫物理壓榨-浸出法等）。提高工藝方法雖能抑制高溫、氧氣等帶來的反式脂肪酸，但部分設備昂貴，難以實現產業化應用。優化工藝參數包括控制加工貯藏中反應溫度、反應時間等方面[14]，但是抑制反式脂肪酸的同時也會影響食品的品質[15]。抗氧化劑主要包括人工合成添加劑和天然添加劑兩大類，常用的人工合成添加劑有丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）、沒食子酸丙酯、特丁基對苯二酚（tert-butyl hydroquinone，TBHQ）和2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）等[16-17]。人工合成添加劑由于其長期使用帶來的毒性累積已經被許多國家禁止使用，例如日本、羅馬尼亞、瑞典和澳大利亞等國禁止在油脂加工領域使用人工合成添加劑，歐洲食品安全局也規定食用油中BHA、TBHQ和BHT等限量標準。而天然活性物質（VE、生育酚、迷迭香等[18]）比人工添加劑更加綠色健康，除了可抑制油脂酸敗變哈外，通常也具有獨特的生理活性作用，因此具有抑制危害物產生和提高健康效益的優點，近年來受到消費者的歡迎，是油脂加工領域發展的必然趨勢[19]。

白藜蘆醇（C14H12O3）是花生中獨特的天然多酚物質，在花生及其副產物中含量豐富，其中仁、紅衣、殼、莖、葉、根中含量分別為0～12.89、0～650、2.5～29.3、8～8.88、0.06～997、0.015～388 μg/kg[20]。由于其結構中具有3 個酚羥基，酚羥基具有較強的自由基清除能力，大量研究也表明白藜蘆醇有抗氧化、抗炎、抑制腫瘤、抗自由基等作用[21-22]。同時研究報道發現其在油中具有抗氧化等作用，且其抗氧化作用優于天然VE，與其他抗氧化劑具有協同增效的作用[23]。目前研究發現白藜蘆醇對花生油具有抗氧化和抗異構作用[3]，且與芝麻酚具有協同增效作用[24]。目前研究雖證明白藜蘆醇具有抗異構作用，但是沒有系統地明晰白藜蘆醇的作用效果、途徑和規律等。

本研究采用花生油為對象，探究白藜蘆醇對花生油熱致反式脂肪酸的抑制效果。分析不同加熱溫度和加熱時間下反式脂肪酸的變化規律，構建動力學模型，確定反應級數、反應速率和抑制率等。同時結合密度泛函理論的方法，建立結構參數與抗異構作用的構效方程[25]，以期為實現反式脂肪酸的精準調控、科學合理設計降低反式脂肪酸的加工工藝而提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

反式白藜蘆醇（標準品，純度＞99%） 阿拉丁試劑有限公司；花生油 山東西王集團有限公司；二甲基硅油（黏度為500 cs） 北京頂業有限公司；異辛烷（色譜級） 美國Fisher Scientific公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

OA-SYS型氮吹儀 美國Organomation公司；T18分散機、RT 10磁力攪拌器 德國IKA公司；KQ-500DE型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；THZ-82(A)水浴恒溫振蕩器 常州榮華儀器制造有限公司；LXJ-IIB型離心機 上海安亭科學儀器廠；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器 美國Scientific Industries公司；GC-2010型氣相色譜儀 日本島津公司。Gaussian 16軟件、GaussianView 6.0 美國高斯公司；SPSS（Version16.0） 美國IBM公司。

1.3 方法

1.3.1 白藜蘆醇花生油的制備方法

采用本實驗室前期增溶方法制備白藜蘆醇花生油[3]。稱取100 mg白藜蘆醇于500 g花生油中，置入棕色避光藍口試劑瓶中，高純氮吹5 min后除去氧氣，在3 000 r/min分散10 s，在500 W功率下超聲40 min，40 ℃水浴振蕩溫度振蕩1 h，50 ℃磁力攪拌3.5 h，5 000 r/min離心10 min后去掉沉淀得到含白藜蘆醇的花生油（175 mg/kg）。

1.3.2 樣品加熱方法

分別取2.5 g白藜蘆醇花生油與對照新鮮花生油于3 mL安瓿瓶中，氮吹除氧，氫火焰加熱封熔。油浴鍋在不同溫度（120、130、140、150、160 ℃）條件下分別加熱0、4、8、12、16、24、28、32 h和48 h。

1.3.3 花生油中白藜蘆醇的檢測

首先采用白藜蘆醇標準品建立標準曲線，相關系數達到0.99以上。稱取2.0 g油樣，加入15 mL 80%乙醇溶液渦旋5 min提取后，轉速5 000 r/min離心10 min，取上層乙醇提取清液。重復步驟，乙醇提取3 次后，合并上清液乙醇提取液并定容至50 mL，濾液過0.22 μm有機濾膜后，采用王強等[26]建立的超高相液相色譜方法檢測白藜蘆醇含量。

1.3.4 花生油中反式脂肪酸的檢測方法

采用Li Tian等[27]的方法檢測樣品中脂肪酸組成和含量。稱100 mg花生油于10 mL離心管中，加入1 mL異辛烷，其中內標為C11:0甲酯標準品，質量濃度為4 000 mg/L。加入50 μL 2 mol/L的氫氧化鉀-甲醇溶液，旋渦混勻1 min，4 000 r/min離心10 min。取上清液20 μL以異辛烷為溶劑定容至1 mL，氣相色譜檢測反式脂肪酸組成和含量。采用CP Sil 88氣相色譜柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm）進行氣相色譜檢測，進樣口溫度230 ℃，進樣量1 μL，分流比10∶1，氮氣流速10.6 cm/s，恒定線速度模式。色譜柱在60 ℃保持5 min，以25 ℃/min速率升溫至160 ℃保持4 min，以2 ℃/min速率升溫至225 ℃保持50 min，以1 ℃/min速率升溫至230 ℃保持5 min。檢測器為氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為230 ℃，尾吹流量為3 mL/min。

1.3.5 白藜蘆醇抗異構率的計算

由于對照組（新鮮花生油）中不含反式脂肪酸（前期已檢測），故白藜蘆醇的抗異構率按照下式計算：

式中：Y為白藜蘆醇在某一溫度下的抗異構率/%；C1為空白花生油中反式脂肪酸的含量/%；C2為相同條件下含有白藜蘆醇的花生油中反式脂肪酸的含量/%。

1.3.6 白藜蘆醇花生油中反式脂肪酸的形成動力學研究

參考郭芹等[17]報道的方法，根據相關系數（R2）值大小確定樣品中形成反式脂肪酸的反應級數，并根據Arrhenius公式計算不同溫度下反應速率（k）、反應活化能（Ea）和反應動力學模型。

1.3.7 Gaussian 16理論計算程序

采用Gaussian view軟件構建白藜蘆醇分子結構模型，根據密度泛函法B3LYP/6-311G（d，p）基組對分子結構模型全幾何構型優化，同時對結構振動紅外光譜分析，當無虛頻產生時確定白藜蘆醇優勢構型，同時獲得此最優白藜蘆醇結構下二面角、鍵長等結構參數。在此基礎上，計算白藜蘆醇結構相關的量化參數，包括自洽場能（ESCF）、零點能（ZPE）、吉布斯自由能（G）、熱力學焓（H）、內稟熱力學能（E）、體積恒定時的熱熔（CV）和總熵（S）等。

1.3.8 相關分析和回歸分析

為尋找反式白藜蘆醇與抗異構作用的定量構效關系，參照游士兵等[28]方法，選擇實驗所得4 個抗異構率為參數，與量化計算得到的量子化學參數進行相關分析和多元線性回歸分析。

1.4 數據處理

每次實驗重復3 次，取平均值，用SPSS（Version 16.0）軟件對數據進行分析。采用OriginPro 8.5軟件畫圖并擬合線性方程和logistic回歸方程，計算相關系數。

2 結果與分析

2.1 花生油中白藜蘆醇的變化

新鮮花生油中沒有經過物理增溶時，市面上多款不同品牌花生油及本實驗所用花生油中均未檢測到白藜蘆醇。經過物理增溶處理后花生油中白藜蘆醇含量為175 mg/L，而隨著加熱溫度的升高和加熱時間的延長，花生油中白藜蘆醇含量不斷降低（圖1A）。采用Origin中的線性方程和logistic回歸方程兩種方式分析了不同溫度下油中白藜蘆醇隨溫度的變化規律（表1）。根據比較相關系數（R2），發現在120～140 ℃條件下，油中白藜蘆醇隨著溫度的升高，兩種擬合方程的R2差異不大（R2＞0.9），白藜蘆醇幾乎是線性減少，且溫度越高，白藜蘆醇減少速率越高。在140～160 ℃條件下，logistic回歸效果良好，擬合度高。白藜蘆醇含量在32 h后變化不明顯，出現明顯的截止效應或非線性效應。在此溫度范圍下，油中白藜蘆醇首先快速降解，而在達到一定水平后不再隨著加熱時間劇烈變化。相較于加熱時間，加熱溫度對油中白藜蘆醇含量影響更大，其中溫度越高，白藜蘆醇熱降解越快，尤其在160 ℃加熱48 h后，白藜蘆醇損失率最高，達到了41.11%。

表1 白藜蘆醇在花生油中不同加熱溫度和時間下擬合方程和相關系數Table 1 Fitting equations and correlation coefficients of resveratrol content in peanut oil at different heating temperatures

圖1 白藜蘆醇在花生油中不同加熱溫度和時間下的含量變化Fig.1 Change in resveratrol content in peanut oil at a function of heating temperature and duration

2.2 花生油中反式脂肪酸變化

花生油中生成的反式脂肪酸主要為單反式油酸C18:1-9t、單反式亞油酸C18:2-9c,12t和C18:2-9t,12c，并且其含量隨著加熱溫度和加熱時間的延長而增加。白藜蘆醇能顯著抑制花生油熱致異構反式脂肪酸的形成，表明白藜蘆醇具有抗異構作用（表2）。隨著溫度的升高，白藜蘆醇對花生油總反式脂肪酸和C18:1-9t的抗異構率不斷減小（30.30%→24.43%和63.57%→38.28%），可能是由于白藜蘆醇在加熱狀態下不斷降解含量減少，抗異構率降低。雙反式亞油酸C18:2-9c,12t和C18:2-9t,12c則先增加后減少，可能是由于120～140 ℃加熱時花生油中產生了大量的反式亞油酸，白藜蘆醇優先抑制反式亞油酸（15.97%→24.40%和8.38%→19.07%）。隨著溫度升高，反式油酸大量生成，同時部分亞油酸也會生成反式油酸，白藜蘆醇抑制反式油酸生成，對反式亞油酸抗異構率下降。

表2 白藜蘆醇在不同溫度下對不同反式產物的抗異構率Table 2 Inhibition rates of resveratrol on production of different trans fatty acids at different temperatures

經過Arrhenius公式計算，根據花生油中反式脂肪酸含量與加熱時間的R2確定反應級數。在實驗溫度和時間內，無論是否含有白藜蘆醇，總反式脂肪酸、C18:1-9t、C18:2-9c,12t和C18:2-9t,12c形成的零級反應R2幾乎都大于一級反應（表3），說明反應都屬于零級反應，即反式脂肪酸形成僅與溫度和時間有關，與其初始濃度無關。進一步計算反應的速率和活化能發現（表4），油中形成C18:2-9c,12t和C18:2-9t,12c所需活化能低于C18:1-9t，即花生油中亞油酸較油酸更容易發生異構。其中C18:2-9c,12t和C18:2-9t,12c所需活化能相近，即C18:2-9c,12t和C18:2-9t,12c異構化幾乎是同時進行。

表3 油中異構化生成C18:1-9t、C18:2-9c,12t和C18:2-9t,12c的相關系數（R2）Table 3 Correlation coefficients (R2) for the formation of C18:1-9t,C18:2-9c,12t and C18:2-9t,12c

表4 白藜蘆醇對花生油熱致異構反式脂肪酸的動力學參數的影響Table 4 Effect of resveratrol on kinetic parameters for production of thermally induced trans fatty acids in peanut oil

不同溫度下白藜蘆醇花生油總反式脂肪酸、C18:1-9t、C18:2-9c,12t和C18:2-9t,12c的形成速率都明顯低于花生油（表3）。白藜蘆醇可顯著提高油中形成總反式脂肪酸（5.91%）、C18:1-9t（5.82%）、C18:2-9c,12t（15.45%）和C18:2-9t,12c（8.05%）所需活化能，從而抑制花生油中反式脂肪酸的形成。這些結果表明，白藜蘆醇具有顯著的抗異構作用，其作用方式主要為降低異構化反應的形成速率和提高能壘。根據上述計算結果，建立花生油中反式脂肪酸在不同加熱溫度（T）和加熱時間（t）下含量的動力學模型（表5），為精準控制油中反式脂肪酸的含量（C）提供理論依據。盡管研究明確了白藜蘆醇具有抑制油中反式脂肪酸形成的作用及其作用方式，但其構效關系尚不清楚，亟待進一步研究。

表5 異構體形成動力學模型Table 5 Kinetic models for isomer formation

2.3 白藜蘆醇的分子結構計算

通過Gaussian優化順反白藜蘆醇結構，其對應的振動紅外光譜（圖2）中皆沒有負值頻率（虛頻），表明優化結構較穩定。順反白藜蘆醇共有11 個吸收峰。從0～4 000 cm-1分別為O—H面外搖擺（338.1 cm-1和341.7 cm-1）、芳環上C—H面外彎曲（487.7、507.5、776.7 cm-1和843.2 cm-1）、C＝C雙鍵上C—H面外彎曲振動（988.4 cm-1和976.0 cm-1）、芳環上C—H搖擺（1 116.3 cm-1和1 153.2 cm-1）、O—H搖擺（11 153.9 cm-1）、C—O伸縮（1 252.8 cm-1和1 255.6 cm-1）、C＝C雙鍵上C—H搖擺（1 432.3 cm-1和1 495.9 cm-1）、芳環C＝C伸縮（1 587.2 cm-1和1 603.5 cm-1）、芳環C—H伸縮（3 043.2 cm-1和3 045.9 cm-1）和O—H伸縮（3 702.2 cm-1和3 702.9 cm-1），這與Zhou Yanyu等[29]的實驗結果一致。

圖2 順式（a）和反式（b）白藜蘆醇的振動紅外光譜圖（校正因子0.967）Fig.2 Vibrational IR spectra of cis-resveratrol and trans-resveratrol(scaling factor 0.967)

在最優結構基礎上，進一步計算順反白藜蘆醇的二面角、鍵長及其他結構參數。二面角是4 個相鄰原子所形成的兩個平面間角度（圖3）。由于白藜蘆醇分子上苯環上原子都在同一平面，因此主要關注兩個苯環面與雙鍵間二面角。順式白藜蘆醇C2-C1-C7-C8和C7-C8-C1’-C2’二面角分別為146.3°和150.9°，表明其扭轉較大；而反式白藜蘆醇C2-C1-C7-C8和C7-C8-C1′-C2′二面角分別為3.2°和2.0°，表明其原子幾乎都在同一平面，即幾何共面性較好。反式白藜蘆醇中C1-C7和C8-C1′鍵長較順式白藜蘆醇更短（1.475 ?→1.466 ?，1.472 ?→1.463 ?），反式白藜蘆醇鍵長更短不容易斷裂表明其結構穩定，這與何云清等[30]的研究結果一致。由于反式白藜蘆醇更加穩定，自然界中白藜蘆醇存在形式多為反式結構，因此本研究也同樣選擇了常見的反式白藜蘆醇作為研究對象。

圖3 順式和反式白藜蘆醇的優化結構Fig.3 Optimal structures of cis-resveratrol and trans-resveratrol

上述實驗結果證實溫度對花生油中白藜蘆醇抗異構作用影響較大，為明晰其白藜蘆醇結構對其在油中抗異構效果間關系，進一步計算白藜蘆醇不同溫度下的量化參數，包括ESCF（-766.572 AU）、ZPE（0.226 Hartree）、G（-766.391 Hartree）、H（-766.330 Hartree）、E（151.310 Cal/（mol?K））、CV（59.054 Cal/（mol?K））和S（127.389 Cal/（mol?K））等。不同溫度下白藜蘆醇量化參數與抗異構率相關分析（表6）結果表明，C18:1-9t相關性最高，總抗異構率次之，其中G與其他計算參數正負相關性相反。為避免共線性導致的模型可解釋性變差，本實驗在多元回歸計算中進一步減少了模型量化參數，選擇E和S兩個量化參數，建立白藜蘆醇抑制花生油熱致異構反式脂肪酸形成的構效關系。

表6 白藜蘆醇量化參數與抗異構率相關系數Table 6 orrelation coefficients (R2) between thermodynamic parameters and anti-isomerization rates of resveratrol

選擇白藜蘆醇對4 種反式脂肪酸抗異構率與兩個量化參數，采用多元線性回歸分析建立白藜蘆醇抑制油中反式脂肪酸的構效模型。該模型不僅明晰了白藜蘆醇與抗異構率間關系，還有助于預測計算類似活性成分的抗異構作用效果。為精準控制花生油中反式脂肪酸提供了理論依據，拓寬了天然抗異構活性物質在食用油領域的應用。

式中：Y1為C18:1-9t；Y2為C18:2-9c,12t；Y3為C18:2-9t,12c；Y4為總抗異構率；x1為E；x2為S。

3 結 論

通過氣相色譜結合液相色譜方法，探究白藜蘆醇對花生油中反式脂肪酸的抑制作用。花生油中白藜蘆醇在120～140 ℃條件下線性減少，在140～160 ℃條件下則出現明顯的截止效應。花生油中反式脂肪酸隨著加熱溫度升高和加熱時間延長不斷增加，且反式脂肪酸形成僅與溫度和時間有關，與其初始濃度無關。白藜蘆醇可明顯降低異構化反應的形成速率和提高反應能壘（5.82%～15.45%），且對總反式脂肪酸的抗異構率隨著溫度升高而減小（對總反式脂肪酸的抗異構率最高為30.30%），同時不改變油中異構化反應級數。并建立了其反式脂肪酸形成模型。為進一步明晰白藜蘆醇結構與其抗異構效果關系，采用多元回歸分析，建立了量化參數（E和S）與抗異構率構效關系模型，有助于精準控制花生油中反式脂肪酸形成，同時拓寬了天然抗異構劑在食用油領域的應用。