茶黃素對新生大鼠心肌缺血保護作用的機制研究

韓 旭,朱 萍,柳 旎,吳宗躍,楊 靜

缺血性心臟病(IHD)是世界范圍內的一種主要致死性疾病[1]。心肌缺血早期可能無明顯癥狀,但隨著病情的發展可能會導致嚴重的臨床后果,對心臟造成損害[2-3]。新生兒發生心肌缺血可能會導致多個器官,尤其是大腦和心臟的缺血性損傷[4-5]。異丙腎上腺素(ISO)是一種β-腎上腺素能受體激動劑[6],過量的ISO可引起大鼠不可逆的急性心肌缺血損傷,是誘發大鼠心肌梗死的藥物[7]。茶黃素是紅茶中的天然多酚,包括茶黃素、茶黃素3-沒食子酸酯、茶黃素3′-沒食子酸酯和茶黃素3,3′-沒食子酸酯[8]。研究顯示,茶黃素具有抗高血糖癥、抗炎和抗病毒的功效[9-12]。茶黃素由于具有超氧陰離子消除和金屬螯合等功能,因此具有抗氧化作用,可介導內源性抗氧化劑系統并清除活性氧(ROS)[13-15]。研究表明,茶黃素可通過激活KATP通道,尤其是線粒體膜上的KATP通道來保護幼年大鼠心臟免于缺血/再灌注損傷,并抑制線粒體通透性轉換孔道(mPTP)的打開[16]。本研究探討茶黃素通過抑制氧化應激和細胞凋亡保護新生大鼠心肌缺血的機制研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

7日齡無特定病原體(SPF)級新生Sprague-Dawley(SD)大鼠25只,購于成都市達碩生物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(川)2020-0039,適應性飼養1周后將大鼠隨機分為對照組、ISO誘導組、茶黃素12.5 mg/kg組、茶黃素25.0 mg/kg組和茶黃素50.0 mg/kg組,每組5只[16]。心肌缺血模型構建后,將新生大鼠放至SPF環境獨立通氣籠(溫度25 ℃,相對濕度40%～70%)中常規飼養,并由雌性大鼠進行母乳喂養。

1.2 心肌缺血模型的構建[17]

茶黃素12.5 mg/kg組、茶黃素25.0 mg/kg組和茶黃素50.0 mg/kg組分別腹腔注射茶黃素12.5、25.0、50.0 mg/kg預處理7 d,每日1次。除對照組外,其余各組新生大鼠在預處理最后2 d皮下注射ISO 85 mg/kg構建心肌缺血模型。

1.3 實驗儀器與設備

AlphaImager HP凝膠成像分析系統購自美國Alpha Innotech公司;FPMOUS-ECGenie小動物心電圖監測儀購自孚光精儀(中國)有限公司;BX60型光學顯微鏡購自日本OLYMPUS公司;MyLab 30 CV彩色超聲儀購自深圳百勝醫療科技有限公司(型號:MYLAB30CVVET);逆轉錄實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)儀(IQTM5型)購自美國Bio-Rad公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 超聲心動圖檢測

2%異氟烷麻醉大鼠后使用配有10 MHz線性陣列的MyLab 30 CV超聲系統進行超聲心動圖檢查,并記錄每只大鼠的心臟結構和功能參數,包括心率(HR)、左室壁相對厚度(LVWT)、左室收縮末期容積(LVESV)和左室射血分數(LVEF)。

1.4.2 蘇木精-伊紅(HE)染色

采用脊椎脫臼法處死大鼠后采集大鼠心肌組織進行HE染色(上海歌凡生物科技有限公司,貨號M020),并于熒光顯微鏡下進行觀察。

1.4.3 酶聯免疫吸附法(ELISA)

眼眶取血獲得外周血樣品分離血清。根據ELISA試劑盒(購于南京建成生物工程研究所)說明書檢測血清肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌紅蛋白(Mb)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和髓過氧化物酶(MPO)的表達水平。采用BIO-RAD酶標儀(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)測定光密度,使用ELISA試劑盒提供的細胞因子標準品建立測量的標準曲線。

1.4.4 蛋白免疫印跡法(Western Blot)

心臟組織加入液氮研磨,并用裂解緩沖液裂解后于4 ℃冷凍離心機以14 000 r/min離心15 min,形成濃縮蛋白質。取20 μg總蛋白進行12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)并轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜,37 ℃下用5%的牛血清白蛋白封閉1 h,然后與抗Cleaved Caspase-9(1∶1 000,ab2324,Abcam)、Bcl-2(1∶1 000,ab32124,Abcam)、Bax(1∶1 000,ab32503,Abcam)、鼠雙微體2基因(MDM2)(1∶2 000,ab226939,Abcam)、p53(1∶2 000,ab179477,Abcam)、磷酸化的核因子E2相關因子2(p-Nrf2)(1∶5 000,ab76026,Abcam)、血紅素加氧酶1(HO-1)(1∶2 000,ab52947,Abcam)和NADPH奎寧氧化還原酶1(NQO1)(1∶10 000,ab80588,Abcam)在4 ℃孵育過夜。用TBS緩沖液洗滌后(含Tween-20的Tris緩沖鹽水)加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(二抗)37 ℃反應1 h;洗膜后電化學發生(ECL)法曝光成像并應用quantity one軟件分析蛋白條帶的灰度值。以上抗體均購于成都博奧維新生物科技有限公司。

1.4.5 免疫組織化學法

新生大鼠心肌用4%多聚甲醛固定24 h,包埋在石蠟中,切成薄片。將石蠟切片在二甲苯中分離,并在梯度乙醇中再水化。在10 mmol檸檬酸緩沖液中提取抗原后,將組織切片在3%H2O2中孵育10 min,并在室溫下密封1 h。然后將心臟組織切片與兔抗Caspase-3抗體(1∶1 000,ab44976,Abcam)一起孵育過夜。將相應的第二抗體在室溫下孵育1 h。在Olympus DX51熒光顯微鏡(Olympus,東京,日本)下觀察圖像。用Image 6.0分析數據。以上抗體均購于成都博奧維新生物科技有限公司。

1.5 統計學處理

2 結 果

2.1 茶黃素治療ISO誘導新生大鼠心肌病理變化

HE染色結果顯示,與對照組比較,ISO誘導組大鼠心肌間隙增寬,心肌細胞嚴重腫脹,附著炎性細胞增加,結構變得模糊。用茶黃素治療后,與ISO誘導組比較,以上現象均得到緩解。詳見圖1。

圖1 HE染色大鼠心肌病理切片(×400)

2.2 茶黃素治療ISO誘導新生大鼠心臟功能變化

與對照組比較,ISO誘導組HR、LVWT和LVEF均明顯降低,而LVESV明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與ISO誘導組比較,茶黃素25.0 mg/kg組、茶黃素50.0 mg/kg組HR、LVWT和LVEF明顯升高,而LVESV明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表1。

表1 各組ISO誘導新生大鼠心臟功能變化比較(±s)

2.3 茶黃素治療ISO誘導新生大鼠心臟損傷標志物變化

與對照組比較,ISO誘導組cTnI、CK-MB和Mb含量明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與ISO誘導組比較,茶黃素25.0 mg/kg組、茶黃素50.0 mg/kg組cTnI、CK-MB和Mb含量明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。詳見表2。

表2 各組ISO誘導新生大鼠心臟損傷標志物變化比較(±s)

2.4 茶黃素治療ISO誘導新生大鼠心臟氧化應激變化

與對照組比較,ISO誘導組SOD含量明顯降低,而MDA和MPO含量明顯升高,差異均有統計學意義(P<0.01)。與ISO誘導組比較,茶黃素25.0 mg/kg組、茶黃素50.0 mg/kg組SOD含量明顯升高,而MDA和MPO含量明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.01)。詳見表3。

表3 各組ISO誘導新生大鼠心臟氧化應激變化比較(±s)

2.5 茶黃素治療ISO誘導新生大鼠心臟細胞凋亡相關蛋白表達變化

與對照組比較,ISO誘導組Caspase-3陽性表達量明顯上調,差異有統計學意義(P<0.05)。與ISO誘導組比較,茶黃素25.0 mg/kg組、茶黃素50.0 mg/kg組Caspase-3陽性表達量明顯下調,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖2、圖3。

圖2 免疫組織化學法檢測Caspase-3陽性表達量

圖3 各組Caspase-3陽性表達量比較(ISO誘導組與對照組比較,＊ P<0.05;與ISO誘導組比較,# P<0.05)

Western Blot試驗結果表明,與對照組比較,ISO誘導組Cleaved Caspase-9/Caspase-9和p53的蛋白相對表達量明顯上調,而Bcl-2/Bax和MDM2的蛋白相對表達量明顯下調,差異均有統計學意義(P<0.05)。與ISO誘導組比較,茶黃素25.0 mg/kg組、茶黃素50.0 mg/kg組Cleaved Caspase-9/Caspase-9和p53的蛋白相對表達量明顯下調,而Bcl-2/Bax和MDM2的蛋白相對表達量明顯上調,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖4、圖5。

圖4 Cleaved Caspase-9、Bcl-2、Bax、MDM2和p53蛋白表達條帶圖

圖5 各組cleaved Caspase-9/Caspase-9、Bcl-2/Bax、MDM2和p53蛋白相對表達量比較(1為對照組;2為ISO誘導組;3為茶黃素12.5 mg/kg組;4為茶黃素25.0 mg/kg組;5為茶黃素50.0 mg/kg組。ISO誘導組與對照組比較,＊ P<0.05;與ISO誘導組比較,# P<0.05)

2.6 茶黃素治療ISO誘導新生大鼠心臟核因子E2相關因子2(Nrf2)/HO-1/NQO1信號通路的變化

Western Blot試驗結果表明,與對照組比較,ISO誘導組p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白相對表達量明顯下調,差異均有統計學意義(P<0.05)。與ISO誘導組比較,茶黃素25.0 mg/kg組、茶黃素50.0 mg/kg組p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白相對表達量明顯上調,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見圖6、圖7。

圖6 Western Blot檢測p-Nrf2、HO-1和NQO1蛋白相對表達條帶圖

圖7 各組p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對表達量比較(1為對照組;2為ISO誘導組;3為茶黃素12.5 mg/kg組;4為茶黃素25.0 mg/kg組;5為茶黃素50.0 mg/kg組。ISO誘導組與對照組比較,＊ P<0.05;與ISO誘導組比較,# P<0.05)

3 討 論

左心室功能障礙與心肌梗死密切相關,最終可導致心室壁變薄[18-19]。心肌酶是心肌損傷的重要標志。本研究HE染色結果顯示,與對照組比較,ISO誘導組大鼠心肌間隙增寬,心肌細胞嚴重腫脹,附著炎性細胞增加,結構變得模糊;在茶黃素干預后,與ISO誘導組比較,以上現象均得到緩解。與對照組比較,ISO誘導組HR、LVWT和LVEF明顯降低,LVESV、cTnI、Mb和CK-MB均明顯升高;在茶黃素干預后,與ISO誘導組比較,HR、LVWT和LVEF明顯升高,LVESV、cTnI、CK-MB和Mb明顯降低,表明茶黃素能夠改善心肌缺血造成的心臟功能損傷。

凋亡在急性心肌梗死病人的心肌細胞死亡中具有重要作用[20]。研究表明,心肌缺血模型大鼠的氧化應激和心肌細胞凋亡會加劇[17,21];腫瘤抑制因子p53主要通過調節細胞凋亡、細胞周期阻滯、衰老、DNA修復和遺傳穩定性來調節細胞的應激反應,負反饋調節主要由MDM2控制[22-23];MDM2通過至少3種機制控制細胞p53的水平和活性[24-25];另有研究表明,茶黃素可能通過下調多種絲裂原活化蛋白激酶途徑來減輕乙醇誘導的胃黏膜上皮細胞氧化應激和凋亡[26]。在本研究中,與對照組比較,ISO誘導組Caspase-3陽性表達量明顯上調,且Cleaved Caspase-9 和p53的蛋白相對表達量明顯上調,而Bcl-2/Bax和MDM2的蛋白相對表達量明顯下調;在茶黃素干預后,與ISO誘導組比較,Caspase-3陽性表達量明顯下調,Cleaved Caspase-9和p53的蛋白相對表達量明顯下調,而Bcl-2/Bax和MDM2的蛋白相對表達量明顯上調,表明茶黃素能夠改善心肌缺血造成的心臟細胞凋亡。在本研究中,與對照組比較,ISO誘導組SOD明顯降低,而MDA和MPO均明顯升高;在茶黃素干預后,與ISO誘導組比較,SOD明顯升高,而MDA和MPO均明顯降低,表明茶黃素可改善心肌缺血造成的心臟氧化應激。

Nrf2通過調節HO-1和NQO1等下游基因對氧化應激損傷發揮保護作用[27-29]。HO-1、谷氨酸半胱氨酸連接酶和過氧化物酶1可消除活性氧[30-31]。研究表明,茶黃素可通過調控Nrf2信號通路減輕七氟醚引起的神經細胞毒性[32]。茶黃素還可通過激活Nrf2/NQO1/HO-1通路糾正線粒體功能障礙來抑制氧化應激和細胞凋亡,從而發揮抗腎臟缺血再灌注損傷的保護作用[33]。在本研究中,與對照組比較,ISO誘導組p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白相對表達量明顯下調;在茶黃素干預后,與ISO誘導組比較,p-Nrf2/Nrf2、HO-1、NQO1的蛋白相對表達量明顯上調,表明茶黃素可激活Nrf2/HO-1/NQO1信號通路改善心肌缺血造成的氧化應激。

綜上所述,茶黃素可減輕ISO誘導新生大鼠心肌缺血,其機制可能與調節Nrf2/HO-1/NQO1信號通路、減輕細胞凋亡和氧化應激有關。