燕麥植物激素信號轉導通路中響應干旱脅迫的關鍵基因

崔思宇,張志芬,付曉峰,劉俊青,楊海順

(內蒙古自治區農牧業科學院 特色作物研究所,內蒙古呼和浩特 010032)

燕麥主要種植在干旱和半干旱地區,干旱是限制燕麥產量的主要因素。短期(14 d)中度干旱脅迫對燕麥根系生長指標及活力有促進作用,重度干旱脅迫持續抑制此類根系指標[1]。干旱導致燕麥結實率下降,空的白色小穗增加[2],株高變矮,葉片數、主莖數、穗數減少,葉片失綠發黃及籽粒產量顯著下降[3],因此,解析燕麥抗旱機制、挖掘抗性基因尤為重要。

轉錄組測序已被廣泛用于解析高粱[4]、向日葵[5]和其他植物[6-10]的抗旱機制,研究結果能夠提供植物對水分脅迫應答的信號通路和相關基因表達的信息。基于高粱轉錄組分析發現,植物激素信號轉導通路相關差異基因的表達模式與生理指標變化趨勢吻合[4]。基于大麻轉錄組分析,了解了烯效唑處理對大麻響應干旱脅迫下植物激素信號轉導過程生長素、脫落酸基因表達水平所發生的變化[7]。基于轉錄組KEGG分析結果表明,ABA合成代謝的關鍵酶,9-順式-環氧類胡蘿卜素雙加氧酶被顯著富集,說明三七可能通過ABA相關合成酶的增加調控干旱應答[8]。與對照相比,山桃干旱處理組的樣本有260個差異表達基因參與72條代謝途徑,顯著富集到淀粉和蔗糖代謝、植物激素信號轉導通路。植物激素參與調節作物生長發育代謝進程,并在抵抗非生物脅迫中起著重要作用[11-12],因此認為植物激素信號轉導通路為應答干旱脅迫的主要代謝途徑之一。

重度干旱脅迫下(田間最大持水量45%),燕麥葉片ABA、JA和SA含量顯著升高, IAA含量顯著降低[13]。JA 參與了干旱脅迫下根系發育的調節,在 PEG 介導的干旱脅迫條件下,細胞分裂素反應的調節與木質部發育密切相關,與細胞分裂素相比,JA 和干旱脅迫促進木質部分化[14]。JA在抵抗環境脅迫的過程中與ABA、乙烯(ET)、SA等植物激素具有協同和拮抗作用[15]。ABA為脅迫反應激素,在抵御非生物脅迫中起著重要作用[16-17]。ABA、ET、SA、赤霉素 (GA)、IAA和油菜素內酯 (BR),它們與JA一起參與復雜的信號網絡響應非生物脅迫[15]。油用向日葵干旱脅迫下,ABA代謝過程中涉及的轉錄因子均表現為上調[18]。目前關于干旱對燕麥內源激素含量的影響報道較多,但關于干旱對燕麥植物激素信號轉導通路中關鍵基因挖掘的報道較少。本研究將利用轉錄組測序,研究燕麥植物激素信號轉導通路中響應干旱脅迫的關鍵基因,為燕麥抗旱機制解析提供依據,也為將來燕麥抗旱基因克隆、驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和處理

選用抗旱燕麥品種皮燕麥“蒙燕1號”為材料,采用盆栽進行培養,基質為陶粒,室溫培養,出苗7 d后,進行干旱脅迫處理,3個處理,分別為正常水分條件(CK)、輕度干旱脅迫(QD,10%PEG6000)和重度干旱脅迫(ZD,20%PEG6000),每個處理6盆。處理7 d后取葉,緩沖液清洗后,用濾紙吸干水分,立即投入液氮中,-80 ℃下儲存備用, 每個處理3次生物學重復。

1.2 RNA-Seq 測序及分析

Trizol法提取總 RNA,質檢合格后建庫測序,對原始數據進行質控后得到clean reads用于后續分析。根據HISAT2的比對結果,利用Stringtie重構轉錄本,Stringtie有效利用轉錄本的豐度信息,能夠組裝出更多的轉錄本,組裝結果也更為準確[19]。并利用RSEM[20]計算每個樣本中所有基因的表達量,篩選FDR<0.05 且|log2FC|>1的基因為顯著差異基因。參考基因組為2020 年 6 月 23 日公開發布的六倍體皮燕麥基因組,網址為 https://wheat.pw.usda.gov/jb/data=/ggds/oat-ot3098-pepsico[21]

1.3 實時熒光定量 PCR(qRT-PCR)分析

為驗證RNA-seq 測序檢測到 DEGs,本研究對8個重點基因進行 qRT-PCR 分析。燕麥Pepsico2_Contig1856.path1 [過氧化物酶體 (S)-2-羥基酸氧化酶基因,GLO1]為內參基因,該基因不同處理表達量均較高,而且相對穩定。引物序列如表1所示,用2-ΔΔCT方法計算試驗樣本中各基因相較于對照樣本中各基因的相對表達量變化,使用GraphPad Prism7.0進行SD及P值分析。

表1 qRT-PCR 所用引物Table 1 Primers for qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 干旱脅迫下差異表達基因(DEGs)鑒定

基于差異分析結果(圖1),篩選FDR<0.05且|log2FC|>1的基因為顯著差異基因(DEGs),與正常水分相比,輕度干旱脅迫下共獲得624個DEGs,258個上調,366個下調,重度干旱下共獲得13 063個DEGs,其中6 564個上調,6 499個下調。CK vs QD、CK vs ZD和QD vs ZD共有28個基因表達相同。282個基因只被輕度干旱脅迫誘導,不能被重度干旱誘導,5 925個基因只被重度干旱脅迫誘導,不能被輕度干旱誘導。

CK表示正常水分條件,QD表示輕度干旱脅迫,ZD 表示重度干旱脅迫。下圖同。

對所有 DEGs 進行 GO 功能注釋,如圖2所示,將這些 DEGs 分為生物過程(biological process)、細胞組分(cellular component)和分子功能(molecular function)3 個子類。生物過程主要富集在代謝過程、細胞過程和單細胞生物過程等。細胞組分主要富集在細胞、組織和膜。分子功能主要富集在催化活性、結合、轉運蛋白活性、核酸結合轉錄因子活性和分子功能調控。

圖2 不同處理間差異基因表達的GO分析

為探索響應干旱的基因功能分類和代謝途徑,在 KEGG 數據庫中對 DEGs 功能進行注釋,如圖3所示。

圖3 燕麥輕度干旱脅迫顯著富集的通路

QD vs CK,植物激素信號轉導通路沒有顯著富集(P>0.05;Q>0.05),共有7個基因表達發生顯著變化,其中生長素信號轉導通路中AFR基因Pepsico1_Contig30676. Pat h1(ARF9)顯著下調,表達量較高。細胞分裂素信號轉導途徑2個CRE1基因Pepsico1_Contig10314. path2和Pepsico1_Contig20676.path2表達下調,表達量較高。

ZD vs CK,KEGG富集分析結果表明DEGs顯著富集在24個通路(P<0.05;Q<0.05)。如圖4所示,22個為代謝途徑,次生代謝物的生物合成和苯丙素生物合成2個代謝途徑,-log10(Q值)>20,極顯著富集,次生代謝物的生物合成通路350基因表達上調,398個下調;苯丙素生物合成通路41個基因表達上調,105個下調。基因信息過程只有1個通路顯著富集DEGs,該通路為真核生物中的核糖體生物發生(Ko03008),富集70個DEGs,其中69個上調;環境信息過程1個通路顯著富集DEGs,為植物激素信號轉導(Ko04075),富集133個基因,其中44個上調,89個下調。

圖4 燕麥重度干旱脅迫KEGG富集顯著差異的通路

2.2 激素信號傳導途徑相關差異表達基因

圖5顯示,ZD vs CK,植物激素信號轉導途徑富集144個DEGs。生長素信號轉導富集34個DEGs,其中29個下調,5個上調,5個AUX1、22個AUXIAA、1個SAUR下調,2個GH3上調,4個ARF基因,其中3個上調,1個下調, Pepsico1_Contig30676.path1(ARF9)和Pepsico1_Contig15350.path2(ARF9)表達量最高。

圖5 燕麥激素信號轉導相關 DEGs 表達模式

細胞分裂素信號轉導富集23個DEGs,7個CRE1,其中 5個下調,2個上調;5個AHP,其中4個下調,1個上調。1個B-ARR上調和10個A-ARR下調。CRE1基因Pepsico1_Contig30644.path2(HK3)和Pepsico1_Contig17818.path2(HK3)表達量較高。

赤霉素信號轉導富集7個DEGs,包括1個DELLA和6個TF,均下調,所有DEGs表達量均不高。

脫落酸信號轉導富集27個DEGs,23個上調,4個下調。1個PYL下調,14個PP2C上調,10個SnRK2,3個下調,7個上調, 2個ABF上調,ABF基因Pepsico1_Contig22851.path2(SAPK8)和Pepsico1_Contig11915.path2(SAPK8)表達量較高。

乙烯信號轉導富集8個DEGs,其中7個下調,1個上調。3個ETR,其中2個下調,1個上調,1個EIN2下調,4個EIN3下調。Pepsico1_Contig16364.path2(ERS1)和Pepsico1_Contig30011.path2(EIL1A)表達量較高。

油菜素甾醇信號轉導富集14個DEGs,11個下調,3個上調。2個BRI1、1個BSK、1個BZR1/2均下調,10個TCH4,其中7個下調,3個上調,MSTRG.60886(XTH22)表達量較高。

茉莉酸信號轉導富集6個DEGs,2個下調,4個上調。1個JAR1下調,5個JAZ1,其中1個下調,4個上調,表達量均不高。

水楊酸信號轉導富集14個DEGs,其中8個下調,6個上調。8個NPR1,其中7個下調,1個上調,4個PR-1均上調,2個TGA,1個上調,1個下調。 Pepsico1_Contig13131.path2(TGAL6)和Pepsico1_Contig23941.path1(TGAL6)表達量較高。

2.3 EGs的qRT-PCR驗證

Pepsico1_Contig2520.path2(ARF,ADP核糖基化因子)、Pepsico2_Contig10105.path1(GH3.5,茉莉酸-酰胺合成酶JAR1亞型X2)、Pepsico2_Contig12697.path1(MPK6, 絲裂原活化蛋白激酶)、Pepsico1_Contig 30614.path1(ACX1,過氧化物酶體酰基輔酶A氧化酶1異構體X1)、Pepsico1_Contig24949.path1(GID1,赤霉素不敏感基因dwarf 1)、Pepsico2_ Contig 11866. path1(MFP2,乙二醛脂肪酸β-氧化多功能蛋白MFP-a異構體X1)和Pepsico1_Contig26945.path2(EBF2,EIN3結合F-box蛋白)在重度干旱脅迫下均顯著上調,Pepsico2_Contig15385.path1(BZR2,油菜素內酯信號轉導的核心轉錄因子)顯著低于輕度干旱脅迫和對照,轉錄組測序和qRT-PCR基因表達變化一致(表2)。

表2 8個基因的實時定量 PCR 和 RNA-seq 結果Table 2 Real-time quantitative PCR and RNA-seq analysis of the eight genes

3 討論

與CK相比,重度干旱脅迫燕麥葉片核糖含量增加5.78%,蔗糖含量增加83.08%,差異顯著(P<0.05,下同);內源酸性激素ABA、JA和SA含量顯著升高,IAA含量顯著降低[12],輕度干旱脅迫變化不顯著。本研究表明輕度干旱脅迫沒有顯著富集的代謝通路,植物激素信號轉導途徑富集7個DEGs,其中ARF和CRE1表達量較高;重度干旱脅迫下有24條代謝途徑顯著富集,環境信號過程只有植物激素信號轉導途徑顯著富集DEGs,說明轉錄組表現和生理表現一致。

內源激素是對外界環境刺激變化最顯著的途徑,本研究表明在重度干旱脅迫下,IAA信號轉導通路和ABA信號通路富集較多的DEGs,分別占激素信號轉導通路總DEGs的20.7%和15.9%,茉莉酸信號轉導中富集較少的DEGs,表達量低。IAA信號轉導通路中生長素反應因子(ARFs)是一種轉錄因子,通過與其啟動子區域的生長素反應元件(Aux REs)結合,激活或抑制初級/早期生長素反應基因的表達[21]。CaARFs的轉錄譜揭示了它們在辣椒幼苗下胚軸插條不定根中的作用[22]。本研究發現在輕度干旱脅迫下,生長素信號轉導中ARF基因Pepsico1_Contig30676.path1(ARF9)下調,表達量較高;該基因在重度干旱脅迫下發生變化同輕度干旱脅迫;重度干旱脅迫下Pepsico1_Contig 15350.path2(ARF9)表達上調,可能為該通路中響應干旱脅迫的關鍵基因。

關于ABA的信號轉導通路對非生物脅迫的研究已有較多的報道,本研究發現燕麥在重度干旱脅迫下,ABA信號轉導通路共富集27個DEGs,主要為PP2C和SnRK2。PP2Cs(2C type protein phosphatases)是一種單體絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶,在真核生物中,PP2Cs在ABA、JA、SA等激素信號傳導途徑中起著重要的調控作用[23]。對花生中35個受鹽脅迫誘導表達的PP2C研究發現,絕大多數PP2C基因的啟動子存在多種脅迫響應元件,如與干旱誘導相關的MYB轉錄因子結合[24]。從小麥中克隆了第一個PP2C基因TaPP2C59,實時熒光定量PCR分析表明,該基因的表達顯著受ABA、低溫和高鹽脅迫抑制,因此,胡 偉等[25]推測TaPP2C59可能作為負調控因子參與ABA信號及非生物逆境脅迫應答。本研究發現在重度干旱脅迫下14個PP2C基因表達均顯著上調,其中MSTRG.2451(PP2C51)表達量相對高。SnRK2是ABA信號轉導途徑中的正調控因子,廣泛參與了植物的生長發育和非生物脅迫等多種信號的應答反應,從番茄中分離了3個SnRK2基因,并進行克隆驗證,發現轉基因植株呈葉片早衰的現象[26]。本研究表明重度干旱脅迫下,燕麥ABA信號轉導途徑10個SnRK2顯著富集,其中Pepsico1_Contig22851. path2(SAPK8)和Pepsico1_ Contig11915. path2(SAPK8)基因表達顯著上調,且表達量較高。ABF(ABRE binding factors)轉錄因子是能夠特異識別ABA響應元件(ABA-responsive element,ABRE)的一類堿性亮氨酸拉鏈蛋白,參與調控ABA響應基因的表達,在植物響應非生物脅迫的過程中具有重要作用[27]。轉錄因子基因SiABF3在干旱脅迫初期的快速表達可能與谷子抗旱性有著緊密的聯系[28]。 本研究表明,在重度干旱脅迫下,2個ABF表達上調,但表達量較小。 因此認為 2個SnRK2為響應重度干旱脅迫的關鍵基因。

細胞分裂素在植物生長發育和抵御環境脅迫過程中均扮演著重要的角色,其信號是由細胞分裂素受體組氨酸激酶、組氨酸磷酸轉運蛋白(HPs)以及反應調節因子組成的復雜的雙元組分系統進行傳遞的[29]。CRE1是細胞分裂素受體,本研究表明,輕度干旱脅迫下,2個CRE1基因表達下調,表達量較高,可能為響應輕度干旱脅迫關鍵基因;重度干旱脅迫下,7個CRE1和5個AHP表達發生顯著變化,其中2個CRE1基因Pepsico1 _Contig30644.path2(HK3)和Pepsico1_Contig17818. path2(HK3)表達上調,且表達量較高,可能為該信號轉導通路中響應重度干旱脅迫的關鍵基因。

當油菜素甾醇存在時,其可與BRI1和BAK1的胞外結構域結合,激活后的BRI1磷酸化激活BSKs,BSKs通過蛋白互作激活BSU1,激活的BSU1可去磷酸化失活負調元件BIN2, 從而解除BIN2對下游轉錄因子BZR1的磷酸化抑制,非磷酸化的BZR1進入細胞核調控[30]。本研究表明重度干旱脅迫下,該通路中的4個基因均顯著下調。At XTH23的缺失賦予了擬南芥植株抗冷性、干旱及ABA敏感性,而在突變體Atxth23中恢復表達大豆同源基因Gm XTH22后的恢復植株可以緩解突變體擬南芥的這些響應脅迫的表型[31]。本研究發現,重度干旱脅迫下,10個TCH4基因表達發生顯著變化,其中MSTRG.60886(XTH22)表達最高。

番茄PR-1和PR-5基因主要在衰老葉片、B期果實和根部表達,干旱抑制了這兩個基因的表達,復水和乙烯誘導其表達[32]。本研究發現在重度干旱脅迫下8個NPR1發生顯著變化,其中7個表達下調;重度干旱脅迫下4個PR-1表達均顯著上調。HAC和NPR1形成一個共激活復合物,并在SA信號后通過TGAs被招募到PR染色質,最后HAC-NPR1-TGA復合物通過組蛋白乙酰化介導的表觀遺傳重編程激活PR轉錄[33]。本研究發現在重度干旱脅迫下 2個TGA,Pepsico1_ Contig13131.path2(TGAL6)和Pepsico1_Contig 23941. path1(TGAL6)表達量較NPR1和PR-1高,因此認為上述2個基因可能為該通路響應重度干旱脅迫的關鍵基因。

ET是植物生理的關鍵元素,因此ET的研究對基礎研究和農業都具有重要意義[34]。克隆芒果乙烯受體ETR1和ERS1基因(Mi ETR1和Mi ERS1),并進行生物信息學分析,結果表明ET受體在芒果成熟和衰老過程中發揮調控作用[35]。ET信號通路轉錄因子EIL1能夠阻礙生長素從果柄向子房運輸,授粉受精或下調表達EIL1均能解除這種阻礙,提高子房IAA水平,形成果實[36]。在突變體中,EIL1基因顯著表達,ET含量增加,影響部分根區干燥下ABA 信號傳導[37]。本研究發現重度干旱脅迫誘導燕麥ET信號轉導中ETR基因Pepsico1_ Contig16364.path2(ERS1)表達顯著上調,EIN3基因Pepsico1_Contig30011.path2(EIL1A)表達顯著下調,且上述2個基因表達量較高,可能為響應重度干旱的關鍵基因。

4 結論

本研究分析了干旱脅迫對燕麥轉錄組的影響,輕度干旱脅迫下,所有代謝通路沒有發生顯著變化,而重度干旱脅迫下,24條代謝通路顯著富集DEDs,其中環境信息過程只有1個代謝途徑顯著變化,為植物激素信號轉導通路,其中以IAA和ABA信號轉導通路表達顯著變化的基因數量較多,在重度干旱脅迫下,篩選出表達量較高的基因12個,分別為Pepsico1_Contig30676.path1、Pepsico1_Contig15350.path2、MSTRG.2451(PP2C51)、Pepsico1_Contig22851.path2(SAPK8)、Pepsico1_Contig11915.path2(SAPK8)、Pepsico1_Contig30644.path2(HK3)、Pepsico1_Contig17818.path2(HK3),MSTRG.60886(XTH22)、Pepsico1_Contig13131.path2、Pepsico1_Contig23941.path1(TGAL6)、Pepsico1_Contig16364.path2(ERS1)和Pepsico1_Contig30011.path2(EIL1A),可能為植物信號轉導通路響應干旱脅迫的關鍵基因。