葛根總黃酮的水提工藝優(yōu)化研究

張國棟，王曉彤，聶文娟，黃武軍，徐向榮

（1.江西農業(yè)工程職業(yè)學院，江西樟樹 331200；2.江西仁仁健康產(chǎn)業(yè)有限公司，江西樟樹 331200；3.仁和集團發(fā)展有限公司，江西樟樹 331200）

葛根（Pueraria DC）又名葛藤，葛麻葉，甜葛藤，粉葛藤等，是豆科（Laguminos ae）多年生藤本植物。世界上有18 種，我國有十余種[1]。其中，野葛（P.lobata(willd)ohwi）具有解肌退熱、生津止渴、透疹、升陽止瀉、通經(jīng)活絡、解酒毒等功效，自古以來主作中藥，用于外感發(fā)熱頭痛、項背強痛、口渴、消渴、麻疹不透、熱痢、泄瀉、眩暈頭痛、中風偏癱、胸痹心痛、酒毒傷中等[2]。

較多學者對葛根主要成分進行了提取、分離和鑒定，發(fā)現(xiàn)葛根的成分有如下幾類：異黃酮類，包括大豆苷元（大豆素、大豆黃素、黃豆苷元）、大豆苷、葛根素等；葛根苷類，包括葛根苷A、B、C 3 種；三帖皂苷類，包括以葛根皂苷A、B、C 命名的7 種新型齊墩果烘型皂角精醇、槐二醇、大豆皂醇B、大豆苷醇A 等；生物堿及其他化合物類。在葛根的有效成分中，研究的最多的是異黃酮類，其中對葛根素的研究更受關注[3]。

研究表明，葛根具有降低血壓、減慢心率、降低心肌耗氧量、擴張冠狀血管、改善正常和缺血心肌的代謝，改善腦循環(huán)、周圍血管及微循環(huán)，抗心律失常、降血糖降血脂、抗腫瘤、抗氧化等作用[4-8]。由于葛根具有多種藥理作用，目前，上市的產(chǎn)品有葛根片、葛根膠囊、葛根口服液和葛根飲料等，擬用葛根提取液進行發(fā)酵，制備成葛根酵素，以填補市場上葛根酵素類產(chǎn)品的空白，對葛根水提工藝進行研究，為葛根酵素的生產(chǎn)奠定試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葛根（干制品），江西仁德中藥飲片有限公司提供；蘆丁（95%），國藥集團化學試劑有限公司提供；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉，均為分析純，西隴科學股份有限公司提供。

1.2 儀器與設備

C21-HT2116HM 型多功能電磁爐，廣東美的生活電器制造有限公司產(chǎn)品；L3 型可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；SHA-C 型水浴恒溫振蕩器，杭州旌斐儀器科技有限公司產(chǎn)品；SHP-160 型生化培養(yǎng)箱，上海鴻都電子科技有限公司產(chǎn)品；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州億通分析儀器制造有限公司產(chǎn)品；高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 葛根總黃酮的測定

采用硝酸鋁顯色法測定葛根提取液中的總黃酮含量[9]，精密稱定50 mg 蘆丁標準品置于50 mL 燒杯中，用濃度為0.1 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解后轉移至25 mL 容量瓶中，定容至刻度，搖勻，即可得質量濃度為2 mg/mL 的蘆丁標準溶液。

精密吸取蘆丁標準溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 至具塞試管中，分別加入1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL 濃度為0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，再加體積分數(shù)為30%的乙醇溶液至5 mL，加入的質量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min 后，加入質量分數(shù)為10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入濃度為1 mol/L 的氫氧化鈉溶液4 mL，加0.4 mL 的水，搖勻，靜置15 min，測定其于波長510 nm 下的吸光度。以吸光度A 為縱坐標，濃度C為橫坐標，繪制標準曲線，線性擬合得到回歸曲線及相關系數(shù)。

1.3.2 提取工藝流程與方法

干葛根→粉碎→過篩→浸提→取上清液→分光光度計檢測。

準確稱量5 g 干葛根，置入高速粉碎機粉碎、過篩，倒入錐形瓶中加入蒸餾水，將錐形瓶置于數(shù)顯恒溫水浴鍋中浸提，取出錐形瓶中提取液，過濾得到濾液，定容至150 mL，精密吸取0.5 mL 提取液，再加體積分數(shù)為30%的乙醇溶液至5 mL，加入質量分數(shù)為5%的亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min后，加入質量分數(shù)10%的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，靜置6 min，加入濃度為1 mol/L氫氧化鈉溶液4 mL，加0.4 mL 的水，搖勻，靜置15 min，測定其于波長510 nm 下的吸光度，代入標準曲線回歸方程，得出黃酮液質量濃度。每個試驗重復2 次取平均值。

1.3.3 單因素試驗分析

以葛根顆粒大小、提取時間、料液比、提取溫度為參數(shù)，提取液黃酮質量濃度為指標進行提取，確定主要影響參數(shù)。

單因素試驗分析各因素與水平設計見表1。

表1 單因素試驗分析各因素與水平設計

進行單因素試驗分析時，除試驗因素的水平按表1 進行，其他因素的水平固定為葛根顆粒大小0.5 cm，提取時間60 min，提取料液比1∶20，提取溫度80 ℃。

1.3.4 正交試驗分析

根據(jù)單因素試驗結果確定3 個影響總黃酮提取的主要因素及各個因素的影響葛根總黃酮得率水平，進行L9（34）正交試驗。

正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 正交試驗因素與水平設計

1.3.5 正交試驗結果驗證

以正交試驗獲得的各個因素的最佳水平組合為參數(shù)，進行提取，計算提取液黃酮質量濃度，試驗平行進行3 次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理軟件Microsift Excel 2010。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 葛根顆粒大小對總黃酮質量濃度的影響

葛根顆粒大小對葛根總黃酮質量濃度的影響見圖1。

圖1 葛根顆粒大小對葛根總黃酮質量濃度的影響

由圖1 可知，葛根顆粒大小為0.25 cm 時，其提取率為最大，達到1.6 mg/mL，隨著葛根顆粒的增大，總黃酮質量濃度降低，但到1 cm 及以上大小時，其總黃酮的提取率變化趨緩。

2.1.2 提取時間對總黃酮質量濃度的影響

提取時間對葛根總黃酮質量濃度的影響見圖2。

圖2 提取時間對葛根總黃酮質量濃度的影響

由圖2 可知，提取時間在80 min 以內，葛根總黃酮的質量濃度隨提取時間的增加而升高，但提取到達100 min，其葛根總黃酮的質量濃度反而下降。

2.1.3 料液比對總黃酮質量濃度的影響

料液比對葛根總黃酮質量濃度的影響見圖3。

圖3 料液比對葛根總黃酮質量濃度的影響

由圖3 可知，料液比在1∶25 以內時，其葛根總黃酮的質量濃度隨料液比的降低而升高，在1∶25時到達頂峰，最后料液比降低到1∶30 時，葛根總黃酮的質量濃度下降。

2.1.4 提取溫度對總黃酮質量濃度的影響

提取溫度對葛根總黃酮質量濃度的影響見圖4。

圖4 提取溫度對葛根總黃酮質量濃度的影響

提取溫度對總黃酮質量濃度影響較大，提取溫度越高，總黃酮質量濃度越高，其變化規(guī)律具有可預見性。因此，在正交試驗時將提取溫度設定為100 ℃。

2.2 正交試驗結果

正交試驗結果見表3。

表3 正交試驗結果

試驗采用直觀分析法，對各因素的K 及R（極差）值的大小進行有關分析可知，極差RA＞RB＞RC。

因此，用水對葛根總黃酮進行提取時，影響總黃酮質量濃度的主要因素為提取時間，其次是料液比，再次是顆粒大小。再由K 值越大越好得出優(yōu)化后最佳組合為A3B2C1，即提取時間100 min，料液比1∶25，葛根顆粒大小0.25 cm。

2.3 驗證試驗

根據(jù)正交試驗結果，選取0.25 cm 葛根顆粒，稱取5 g 分別放置在3 個錐形瓶中，按照1∶25 的料液比加入水，在100 ℃下進行提取，提取時間為100 min，提取液自然冷卻后加水補足損失的質量，測定總黃酮質量濃度，重復3 次試驗，結果分別為1.274，1.261，1.276 mg/mL，平均總黃酮質量濃度為1.27 mg/mL，對比其各參數(shù)其他水平下所獲得的質量濃度，該結果為最高，表明正交試驗方法得當，結果可靠。

3 結論

通過單因素試驗分析影響葛根總黃酮提取的4 個因素，表明4 個因素對于總黃酮質量濃度的影響均較大，但是由于溫度越高，質量濃度越高，為了提升試驗效果，因此在正交試驗時將提取溫度這個參數(shù)定為100 ℃，以提取時間、料液比和顆粒大小3 個因素開展三因素三水平正交試驗。結果表明，葛根顆粒大小0.25 cm，料液比1∶25，提取溫度100 ℃，提取時間為100 min 條件下進行提取，獲得葛根總黃酮質量濃度為最高，為1.27 mg/mL。

在企業(yè)中以葛根為原料生產(chǎn)相關的藥品或者食品時，其提取一般按照師傅傳承下來的經(jīng)驗進行，參數(shù)為固定的，未進行科學的優(yōu)化。通過對葛根提取進行單因素試驗和正交試驗，能夠提高葛根的利用率，縮短提取時間，降低能量的消耗，降低企業(yè)的生產(chǎn)成本，提升企業(yè)的效益。通過單因素試驗和正交試驗確定了葛根提取的工藝參數(shù)，為后續(xù)葛根酵素的發(fā)酵生產(chǎn)奠定了良好的試驗基礎。