后基因組時代發展抗除草劑作物的機遇及挑戰

吳元龍，惠鳳嬌，潘振遠，尤春源，林海榮，李志博，金雙俠，聶新輝

后基因組時代發展抗除草劑作物的機遇及挑戰

吳元龍1，惠鳳嬌2，潘振遠1，尤春源3，林海榮1，李志博1，金雙俠2，聶新輝1

1石河子大學農學院/新疆生產建設兵團綠洲生態農業重點實驗室，新疆石河子 832003；2華中農業大學植物科學技術學院/作物遺傳改良全國重點實驗室，武漢 430070；3石河子農業科學院棉花研究所，新疆石河子 832011

全球農業正在面臨著嚴峻的挑戰，育種技術是種業發展的基礎和關鍵。基因編輯技術是指對目標基因進行定點修飾，實現對特定靶標基片段的刪除、插入和替換。利用基因編輯技術可以精準修改目標基因或將某種優良基因引入到作物中產生優良農藝性狀，在分子設計育種中具有巨大潛力，對保障糧食安全具有重大意義。雜草危害對作物的產量和品質影響巨大，如何高效、安全、可持續地防治草害一直是研究的熱點。目前，全球市場已經出現超過200種的化學除草劑，利用化學方法來防治草害已成為現代化農業的重要組成部分，抗除草劑作物的推廣也顯著降低了雜草防治成本，但隨著抗除草劑作物的大面積推廣和長期使用單一除草劑，雜草抗/耐藥性和抗性基因逃逸等環境安全問題逐漸被發現。目前，功能基因組學、生物信息學、基因工程技術的發展（特別是基因編輯技術在植物中的廣泛應用），為創制抗除草劑作物和新型高效的除草劑系統創造了條件。本文首先介紹抑制植物氨基酸生物合成、植物脂類代謝、植物類胡蘿卜素、質體醌和生育酚生物合成途徑除草劑的主要作用靶標基因及其作用機制。其次，介紹2種挖掘新型抗除草劑基因與除草劑系統的方法，包括基于CRISPR/Cas系統對作物內源的除草劑抗性基因進行定向突變方法和基于天然產物與生物體在自然界中存在共同進化理論的抗性基因導向方法。同時，介紹3種培育抗除草劑作物方法的研究進展，包括常規育種培育法、轉基因育種培育法和基于CRISPR/Cas基因組編輯技術培育法。其中，重點介紹CIRSPR/Cas系統、堿基編輯技術和Prime-editing系統在培育抗除草劑作物中的研究進展。針對抗性雜草的產生及環境安全問題是當前化學防治雜草面臨的主要挑戰，以及抗除草劑作物所面臨的主要挑戰是基因逃逸問題。目前，快速發展的基因組編輯技術為后基因組時代發展抗除草劑作物提供了新的解決策略和新的機遇。最后，對除草劑作物的未來進行了展望。

基因編輯技術；除草劑；抗除草劑基因；抗除草劑作物育種

0 引言

人類為了獲取食物進行農業生產，隨著世界人口的不斷增長和環境問題的日趨嚴峻，農作物產量和品質的提高成為亟須解決的重要科學問題，任何影響作物生產力的因素都應該被高度重視[1]。其中，農田雜草是影響作物產量和品質的重要因素，雜草防治是作物生產中的關鍵環節。雜草具有較強的環境適應性和抗逆性[2]，與農作物競爭生長資源（包括光照、水分和養分等）和空間條件[3]，增加田間病害蟲的發生，釋放有毒物質造成糧食減產[4]。因此，雜草會直接影響作物產量，阻礙農業的快速、健康、可持續性發展。世界農田雜草種類繁多，超過上百種雜草具有較大危害性，造成作物平均減產可達15%以上，造成的直接經濟損失近千億元[5-7]。有報道顯示，雜草危害水稻產量可達40%以上[8]。開發高效，可持續的草害防治措施成為現代農業發展的重要戰略目標之一，也一直是研究者研究的熱點問題。

雜草防治有多種方法，人工除草可以有效減少雜草危害，但是這種方法費時費力，效率低下，不符合現代農業的發展趨勢。化學除草由于操作簡單，經濟有效而被廣泛應用。除草劑不僅具有除草速度快和效率高的特點，而且適應于機械化種植、病蟲害綜合防治和耕作制度的改革。因此，噴施除草劑是防治雜草的主要手段。目前，全球市場已經出現超過200種的化學除草劑，除草劑的年產量已居農藥之首，利用化學方法來防除草害已成為現代化農業的重要組成部分，對全球糧食生產作出了重大貢獻[1, 9]。除草劑的分類方式多樣，如根據作用方式可以將除草劑分為選擇性除草劑（如苯磺隆、敵稗和苯達松等）和滅生性除草劑（如草甘膦和草銨膦等）；根據有效成分可以將除草劑分為以無機物或有機物為原料，經過化學反應或機械加工而制成的化學除草劑（具有不同化學結構的除草劑類型已超過20余類）和利用生物活體或生物代謝產物制成的生物除草劑；根據在作物體內的移動情況可以將除草劑分為觸殺型除草劑（百草枯、乙氧氟草醚等）和內吸型除草劑（2,4-D丁酯、雙草醚、草甘膦）等等。

世界范圍內長期、廣泛使用某一類型的除草劑，造成的雜草抗藥性和基因逃逸、藥害殘留等環境安全問題日益顯現，備受全球關注，因此，有必要研發出更高效的除草劑，以及培育出抗除草劑的作物新種質[1]。基于環境友好與可持續性考慮，對于新型除草劑的要求也越來越嚴苛，它不僅要高效殺滅雜草，還需要考慮安全無公害，適應環境和不影響作物本身的生長發育等因素。因此，如何獲得選擇性強，作用機理獨特，安全高效，對環境和人類的影響極小的除草劑就顯得尤為重要。另一方面，這也對抗除草劑作物發展提出了新的要求。針對目前雜草防治的瓶頸問題，一方面已經從一些微生物、動物、植物中挖掘到一些抗除草劑基因。同時，基于雜交育種以及植物基因工程的發展，成功獲得了一些可以耐受特定除草劑的作物，為一些滅生性除草劑的大面積推廣提供了條件，極大地降低了雜草防治的成本[10]。隨著功能基因組學，代謝組學和蛋白質組學以及基因工程技術（特別是基因編輯技術）的快速發展，為解決雜草危害提供了新的切入點和發展方向，為解決除草劑面臨的挑戰創造了條件。為了闡明抗除草劑作物的發展，本文將對除草劑的主要類型及其作用機制進行簡介；進一步介紹新型抗除草劑及其基因系統的挖掘；最后介紹抗除草劑作物的培育及基于后基因組時代發展抗除草劑作物的機遇與挑戰，以期為環境友好型除草劑的開發和抗除草劑作物的培育提供理論參考。

1 除草劑作用主要靶標基因及其作用機制

研究除草劑的作用靶標基因，可以為研制新型除草劑與抗除草劑作物的培育提供重要的參考價值。植物為了維持其正常的生長發育，需要不斷地進行呼吸作用、光合作用、蛋白質和脂類等物質的代謝，這些代謝通路的維持對于植物生長發育具有重要作用[11-12]。通過阻礙這些代謝通路來達到殺死雜草的目的是許多除草劑的主要作用機制。目前，主要有以下幾種不同作用機制的除草劑，抑制植物氨基酸生物合成途徑、抑制植物光合作用、抑制植物呼吸作用、抑制植物微管與組織發育的化學除草劑和干擾植物激素平衡、利用生物活體或生物代謝產物制成的生物除草劑。

1.1 抑制植物氨基酸生物合成

氨基酸是蛋白質的基本組成成分，而蛋白質是生命的執行者，目前，抑制氨基酸和蛋白質代謝的除草劑主要有3種類型，分別是抑制支鏈氨基酸（branched chain amino acid，BCAA）生物合成類、抑制芳香族氨基酸合成類和抑制植物氮代謝類。

BCAA是指分子結構中的R基團具有支鏈碳鏈，包括亮氨酸、纈氨酸和異亮氨酸，均屬于人體必需氨基酸[13-14]。由于植物無法像動物一樣從食物中吸收支鏈氨基酸，必須自身合成，因此，支鏈氨基酸生物合成途徑對于植物生長至關重要。同時，動物體內不存在該代謝途徑，因此，靶向該途徑的除草劑具有高度特異性與安全性是目前僅次于草甘膦的重要化學除草劑之一。支鏈氨基酸生物合成途徑是由丙酮酸經乙酰乳酸合酶（acetolactate synthase，ALS）、乙酰羥酸異構還原酶（aceto hydroxyacid isomeroreductase，AHIR）和二羥酸脫水酶（dihydroxyacid dehydratase，DHAD）催化形成纈氨酸和亮氨酸，以及由α-酮丁酸經上述3種酶催化形成異亮氨酸2條代謝通路構成（圖1-A），其中，ALS、AHIR和DHAD酶即為支鏈氨基酸生物合成途徑的關鍵酶[14]。ALS也稱為乙酰羥基酸合成酶（acetohydroxy acid synthase，AHAS，EC2.2.1.6）具有催化形成乙酰羥基丁酸酯和乙酰乳酸酯的功能。目前，已經開發出許多靶向ALS的除草劑，這類除草劑具有廣譜性、活性高、選擇性強、對動物低毒性的特點，使其在全球范圍內得到了廣泛應用。其作用機制均是抑制ALS活性，阻礙植物支鏈氨基酸的合成，進而影響蛋白質合成、細胞分裂和植物生長，最終導致植物枯萎死亡[15]。而靶向AHIR和DHAD的除草劑還處于研究階段，其中，已有研究表明，aspterric acid（AA）可以靶向DHAD，阻礙支鏈氨基酸生物合成途徑，是具有廣譜、高效、低毒性的新型綠色除草劑。相信在不久的將來靶向DHAD的除草劑將會被推廣應用[16]。

芳香族氨基酸（aromatic amino acids）是指分子結構中帶有苯環結構的氨基酸，如酪氨酸（tyrosine）、苯丙氨酸（phenylalanine）和色氨酸（tryptophan）。其生物合成是通過莽草酸途徑（shikimate pathway）形成[17]。其中，葉綠體酶5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase，EPSPS，EC2.5.1.19），催化莽草酸-3-磷酸（shikimate- 3-phosphate，S3P）和磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）形成5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸（5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate，EPSP）（圖1-B）。目前，世界上使用最廣泛和最重要的除草劑草甘膦（glyphosate）的靶向位點就是上述的葉綠體酶EPSPS[18]。草甘膦自1974年問世以來，已在全球廣泛使用，是一種具有穩定C-P鍵的磷酸鹽化合物，是具有環境友好性的非選擇性除草劑，可以廣泛控制一年生和多年生雜草。其作用機制是當草甘膦經植物莖葉吸入體內后，由于草甘膦的化學結構與PEP相似，二者競爭結合EPSPS，但不會影響S3P和EPSPS的結合，最終會形成草甘膦：EPSPS:S3P三元復合物，阻斷EPSPS與PEP的結合從而抑制EPSPS的活性，導致前體物質莽草酸大量積累，植物所需的芳香族氨基酸無法正常合成，影響植株正常的氮代謝活動并最終導致死亡[18-19]。

谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase，GS，EC6.3.1.2）具有將谷氨酸和氨轉化為谷氨酰胺的酶活，是谷氨酰胺合成關鍵酶，也是植物氮代謝的關鍵酶（圖1-C）。靶向GS的化合物有L- phosphinothricin、phosalacine、tabtoxinine-β-lactam和oxetin[20]。其中，作為除草劑應用比較廣泛的就是草銨膦（phosphinothricin，PPT），其作用機制是草銨膦為谷氨酸的類似物，會與谷氨酸競爭GS結合位點，抑制氮代謝，導致細胞內氨積累，最終導致植物枯萎死亡[21]。

A：支鏈氨基酸生物合成途徑及抑制乙酰羥基酸合成酶除草劑的作用位置模式圖；B：抑制5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶除草劑的作用位置模式圖；C：抑制谷氨酰胺合成酶除草劑的作用位置模式圖。GS：谷氨酰胺合成酶；GOGAT：谷氨酸合成酶

1.2 抑制植物脂類代謝

脂類對于植物細胞維持正常功能具有重要作用，乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACCase，EC.6.4.1.2）將乙酰CoA羧化生成丙二酰CoA（圖2），該步驟是脂類和脂肪酸合成的關鍵限速步驟[22]。在植物中，ACCase有2種同功異構酶，其中，對除草劑敏感的異構酶是一個分子量約為220 kDa多官能團蛋白質，包含4種截然不同的蛋白質的多酶復雜結構。目前，已知有許多靶向ACCase的除草劑，包括芳氧苯氧丙酸（aryloxy phenoxy propionate，APP）、環己二酮（cyclohexanedione，CHD）和苯吡唑啉（phenyl pyrazoline，PPZ）的化學基團等[1]。這些除草劑的作用機制是通過抑制植物脂類合成途徑中的關鍵酶ACCase酶活性，影響脂類合成而導致植物枯萎死亡。

圖2 抑制乙酰輔酶A羧化酶除草劑的作用位置模式圖[4]

1.3 抑制植物類胡蘿卜素、質體醌和生育酚生物合成途徑

類胡蘿卜素、質體醌和生育酚生物合成途徑之間具有相關性（圖3），其中，類胡蘿卜素在光合作用、光保護和抗氧化作用中的輔助采光作用中發揮著重要作用；質體醌在光合磷酸化中起重要作用；生育酚是重要的抗氧化劑。在該生物合成途徑中具有一些重要的關鍵基因，包括對羥苯基丙酮酸雙氧化酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）、1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶（1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase，DXS）、茄尼基焦磷酸合酶（solanyl diphosphate synthase，SPS）、尿黑酸茄尼酯轉移酶（homogentisate solanesyl transferase，HST）和八氫番茄紅素脫氫酶（phytoene desaturase，PDS），均是重要的除草劑靶標基因（圖3）。其中，研究比較多的靶向基因為。HPPD是生物體內參與酪氨酸代謝的關鍵酶，催化羥基苯丙酮酸（4-hydroxyphenylpyruvate，HPPA）轉化為尿黑酸（homogentisic acid，HGA），HGA是植物生物合成質體醌和生育酚的重要前體，質體醌是類胡蘿卜素的生物合成前體，因此，在光合作用中發揮著重要作用[23]。生育酚是植物體內重要的抗氧化物質。HPPD抑制劑類除草劑的作用機制是可以與HPPD酶活性位點的Fe2+螯合，阻斷HPPD與底物HPPA的結合，形成對HPPD的競爭性抑制，阻斷植物中質體醌和生育酚的形成[4]。

2 挖掘新型抗除草劑基因與除草劑系統

抗除草劑作物（指在通常致死劑量的除草劑作用后仍然能夠存活并再生的作物）的推廣會導致雜草抗藥性產生和基因逃逸等環境問題，單一種類除草劑的使用也會加速雜草抗藥性的進化[3]。因此，挖掘新型作用機制的抗除草劑基因（型）和新型高效的除草劑系統就顯得尤為重要。

HPPD：4-羥基苯基丙酮酸雙氧化酶；DXS：1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合成酶；SPS：茄尼基焦磷酸合酶；HST：尿黑酸茄尼酯轉移酶；PDS：八氫番茄紅素脫氫酶

傳統抗除草劑基因的挖掘是在除草劑環境條件下進行物理或化學誘變，獲得目標抗性材料后利用分子育種手段定位獲得目的基因，或者是從天然微生物中挖掘抗性基因如鼠傷寒沙門氏菌中克隆到的抗草甘膦的aroA基因[24]，來自吸水鏈霉菌的抗草銨膦的BAR（bialaphos resistance）和PAT（phosphinthricin acetyltransferase）基因[25]。但這些傳統的育種方法存在效率較低，育種周期長，工作量大的弊端。目前，隨著功能基因組學和生物技術的快速發展，育種技術也由傳統的分子育種迅速地轉型進入到后基因組學時代，為綜合利用基因組數據和生物信息學數據鑒定新型抗除草劑基因和開發新作用機制的除草劑提供了新的方法和思路。

針對已知的除草劑抗性基因，一方面研究者利用clustered regularly interspaced palindromic repeats/ CRISPR-associated proteins system（CRISPR/Cas）系統對作物內源的除草劑抗性基因進行定向的飽和突變，發現了大量新的抗除草劑基因型[26-27]。如：有研究者利用基于prime editors系統的prime editing library-mediated saturation mutagenesis（PLSM）方法，對水稻ACCase基因CT結構域進行了飽和突變，篩選出16種具有不同氨基酸替換類型的新型抗除草劑基因[28]。另一方面，針對單一除草劑抗藥性的問題，可以利用基因編輯技術在作物中同時聚合多個除草劑抗性，創制多抗除草劑作物，通過多種除草劑的復合交替使用，可以有效避免單一抗性的弊端。如，基于單堿基編輯技術的發展，周煥斌團隊利用開發出的TadA9腺嘌呤單堿基編輯器，成功對水稻主栽品種南粳46中的4個除草劑靶標基因實現了一次性的同時改造，4個靶點共編輯效率高達56.25%[29]。除此之外，日本埼玉大學首次鑒定出的水稻廣譜抗除草劑基因HIS1（HPPD inhibitor sensitive 1，HPPD抑制劑敏感1），賦予了水稻對雙環磺草酮（benzobicyclon，BBC）和其他β-三酮類除草劑的抗性，為抗除草劑基因的挖掘也帶來了希望與啟發[30]。

據最新統計，全球已發現268種（154種雙子葉，114種單子葉）雜草的521個生物型，雜草已經進化出對31種已知除草劑作用位點中的21種和165種不同除草劑的抗性（國際抗除草劑雜草數據庫，https://weedscience.org/Home.aspx）。因此，研制新型抗除草劑基因與除草劑系統，就顯得十分迫切。研究表明，天然產物與生物體在自然界中存在共同進化理論，該理論認為天然產物和生物之間存在共進化關系，該理論已經在醫藥健康及農業生產中得到了廣泛的應用[17]。據此，研究者提出了基于抗性基因導向方法挖掘新型作用機制的除草劑系統的方法。如，研究者以支鏈氨基酸通路中的關鍵酶DHAD為研究對象，利用已公布的真菌基因組數據，篩選獲得含有天然產物（可轉化成除草劑）合成基因與DHAD同源基因（astD）的保守基因簇[17]。在保守基因簇中的DHAD基因型和產生的天然產物構成了潛在的新型作用機制除草劑系統。接著研究者試驗證明天然產物aspterric acid可以作用于DHAD抑制植物生長，利用真菌自身的抗性基因可培育具有抗aspterric acid的抗性植物。最終證明天然產物aspterric acid可以作為除草劑且鑒定到其抗性基因（astD）[16]。中國農業科學院煙草研究所從海洋真菌中篩選到除草活性顯著的Xanthone類化合物，對以反枝莧、綠莧等為代表的莧屬雜草的最小抑草濃度達到8 μg·ml-1，活性達到傳統草甘膦的4倍，是一種新型的天然產物除草劑[31]。華中農業大學從海洋細菌sp. YM12中克隆到抗草銨膦基因，編碼的蛋白在體外酶活試驗中發現與bar基因或pat基因編碼的蛋白具有不同的酶學特征，氨基酸序列同源性僅為37%，屬于一種全新的抗草銨膦基因[32]，該團隊同時從中克隆得到新型抗性基因Ⅰvariabilis- EPSPS，其編碼的蛋白對草甘膦具有一定的抗性，且與Ⅱ類EPSPS基因同源性較低，是一種新型的草甘膦抗性基因[33]。這種基于基因組學與生物信息學的挖掘方法大大提高了發現新型除草劑系統的有效性與高效性。基于化學工程技術，利用氮化碳納米材料可實現多種磺酰脲類除草劑的可見光催化降解，通過單原子修飾可顯著提高納米材料的性能，使目標除草劑降解速率提高4倍，有效地減輕磺酰脲類除草劑對后茬敏感作物的藥害，為環境友好型除草劑的開發提供了新的思路[34]。基于結構生物學，已有研究者對乙酰羥酸合成酶AHAS突變體（W574L和P197T）與除草劑CE或BS結合的晶體結構進行解析，發現這些突變可降低除草劑與AHAS的結合親和力，并阻礙除草劑對乙酰羥酸合成酶的時間性氧化失活，進一步揭示了雜草通過AHAS突變獲得除草劑抗藥性的結構機制，為新型除草劑的設計與開發奠定理論基礎[35]。

3 抗除草劑作物的培育

目前，創制抗除草劑作物的主要途徑包含常規育種、轉基因育種和基于CRISPR/Cas基因組編輯技術育種。

3.1 常規育種培育抗除草劑作物

常規培育抗除草劑作物新品種的方法主要有雜交選育法、自然選擇培育法、物理或者化學手段（輻射、花粉誘變、種子誘變、體細胞誘變和化學誘變劑等）組織培養法等。雜交選育主要是育種家在獲得抗性作物材料后，通過將其與優良的栽培品系進行雜交，從中篩選聚集雙親優良性狀的抗除草劑品種。誘變育種是指通過化學、物理（紫外線和X射線等）或可移動的遺傳因子等因素誘發生物體的遺傳物質產生遺傳變異，并篩選出具有目標性狀突變個體進行新品種培育的過程。利用突變育種技術已經在玉米、小麥、水稻、油菜、向日葵等作物中培育了許多抗除草劑作物，如：抗磺酰脲的小麥[36]，抗咪唑啉類和磺酰脲類的向日葵[37]和抗磺酰脲類除草劑大豆[38]等。誘變育種培育的抗除草劑作物為非轉基因作物，推廣應用阻力較小[26]。綜上，這些方法操作簡單，可獲得的突變范圍相對較大，但獲得抗性作物的周期較長，工作量較大，突變的低概率和隨機性使得培育過程變得低效，且幾乎不可能同時誘導產生多個特定突變體材料[39]。

3.2 轉基因育種培育抗除草劑作物

轉基因育種是指通過引入一個或多個優良基因，來改良目標農藝性狀的育種方法。目前，大部分商業化的抗除草劑作物均是通過這種技術獲得，約占全部轉基因作物的25%[39]。針對靶標抗性主要是通過超量表達外源抗性靶標基因或修飾除草劑靶標蛋白（降低酶與除草劑的結合親和力）的方式來創制抗除草劑作物。目前，超量表達外源抗性靶標基因主要有CP4菌株的、（，葉綠體轉運肽）等變體、草甘膦-N-乙酰轉移酶（glyphosate N-acetyltransferase，GAT）基因和草甘膦氧化還原酶（glyphosate oxidoreductase，GOX）基因等[34, 40-42]，并成功培育了抗溴苯腈棉花、抗草胺膦的油菜和抗草甘膦大豆等[43-44]，在大豆、油菜、玉米、苜蓿、水稻和棉花等農作物中得到了廣泛應用[45-46]。如：在大豆中超表達G2-EPSPS和GAT基因，創制了既能抗草甘膦又能夠以排毒機制降解體內殘留草甘膦的大豆材料[47]。針對非靶標抗性的引入降解/轉移除草劑的酶或酶系統方式，包括膦絲菌素乙酰轉移酶（PAT）基因、雙丙氨磷抗性（Bar）基因和細胞色素P450等[48]。此外，也有過表達外源抗性靶標基因和非靶標抗性基因相結合的應用[49]。然而，轉基因育種培育抗除草劑作物受限于操作繁瑣、勞動密集型、成本高和食品、環境與生物安全監管程序繁瑣等因素。據農業農村部的數據（http://www.moa.gov.cn/ztzl/zjyqwgz/ spxx/index.htm），目前，我國獲得轉基因生物安全證書的抗除草劑作物只有玉米（、、和、和、和、、、maroACC基因）和大豆（、和）。

3.3 基于CRISPR/Cas基因組編輯技術培育抗除草劑作物

基因組編輯技術是一種以插入、缺失或堿基替代的方式在目標序列中產生突變以實現DNA修飾的技術。基因組編輯由多種基本技術組成，如ZFNs（鋅指核酸酶）、TALENs（轉錄激活因子效應物核酸酶）和CRISPR/Cas9（聚類規則間隔短回文重復序列及相關蛋白9）系統。目前，基于CRISPR-Cas系統的基因組編輯技術正以前所未有的速度、深度和廣度影響著生命科學基礎研究、應用研究及人類健康等領域，使精確和高效地編輯目標基因序列由可能變成了現實。CRISPR-Cas系統是原核生物的一種獲得性免疫系統，由單鏈RNA引導的內切酶可以在基因組的特定靶標位點引起變異，經過人工改造后主要包含向導RNA（gRNA）和Cas蛋白兩部分[50-51]。

3.3.1 基于CIRSPR/Cas系統培育抗除草劑作物 Cas蛋白在切割DNA雙鏈后會造成雙鏈斷裂（double- strand break，DSB），緊接著引發生物體內存在的修復機制來修復損傷DNA：一種是非同源末端連接（non-homologous end joining，NHEJ），這種修復機制不精確，在修復過程不可避免地發生堿基插入或缺失，引起基因的移碼突變；另一種是同源重組修復（homology-directed repair，HDR），以供體DNA作為模板進行修復，借助這種修復機制可以根據所提供DNA模板的不同實現精準基因插入或堿基修飾等[52]。在高等動植物中，以NHEJ機制進行修復的頻率顯著高于以HDR的頻率，因為NHEJ機制可在細胞處于任何時期時發生，而HDR機制則僅在特定的細胞周期（S及G2期）發生[53]。

目前，應用范圍廣泛、高效的基因編輯工具主要包括CRISPR-Cas9和CRISPR-Cas12a[54]2種，這兩種系統目前已經在水稻、小麥、煙草、玉米、馬鈴薯、番茄、向日葵、大豆、苜蓿等多種作物中得到了廣泛的應用。利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術，基于NHEJ修復方式，以為靶點進行精準突變，成功在水稻中篩選獲得一個新的除草劑（咪唑乙煙酸）耐受性等位基因[55]。但另一方面，基于HDR的技術挑戰性更大，相對于動物細胞和人類細胞，植物中存在細胞壁的阻礙，在進行HDR過程中面臨的巨大挑戰就是如何把足夠的供體分子輸送到細胞中去，且保證供體分子在植物細胞中不被降解或被轉移到胞質中[56]。但也有一些成功的案例值得借鑒。目前，已經開發了不同的方法提高HDR的效率，包括細胞周期的調控[57]、修復途徑關鍵蛋白表達的調節、提高修復模板的供應量[58]、優化供體修復模板（donor repair template，DRT）的設計[59]。例如，在玉米中，利用單鏈寡核苷酸（single stranded oligonucleotide，SSON）或雙鏈DNA載體作為DRT，實現了ALS2中P165S的氨基酸精準替換，獲得了對氯磺隆抗性的玉米編輯植物。Sun等[60]利用CRISPR/Cas9系統，設計了2個sgRNA（small guide RNA）和一個供體修復模板，通過在供體兩端添加靶標序列來增加游離的供體數量，以基因槍轟擊的方式在水稻中實現了ALS基因中W548L和S627I 2個氨基酸殘基的同時精確替換；2018年，該團隊又利用CRISPR/Cas12a基因編輯系統，以DNA作為HDR的模板，實現了ALS中相同氨基酸位點的精確替換[61]；2019年，夏蘭琴團隊利用CRISPR/Cpf1基因編輯系統，以RNA作為HDR的模板，對ALS的2個氨基酸位點（W548L和S627I）進行定點替換，成功獲得無轉基因成分的抗ALS抑制劑類除草劑水稻植株[56]。該研究是在植物中首次成功利用RNA作為同源重組修復模板，開辟了利用植物RNA作為同源供體模板進行同源修復的新思路。以上都是基于基因組編輯技術創制抗除草劑作物的成功案例，除此之外，在方法創新上，通過改造小麥矮縮病毒（wheat dwarf virus，WDV），利用其能侵染大多數單子葉和雙子葉植物，以及病毒能夠大量復制的特性，轉化水稻愈傷組織發現其提供供體分子的數量是傳統T-DNA的數百倍。該研究進一步把CRISPR/Cas9系統和WDV系統整合，輔以定向篩選的方式，對水稻內源的ACT1和GST位點定點插入GFP標記，對轉化植株的鑒定表明外源基因定向敲入的效率最高可達到19%[58]；2020年，朱健康院士團隊又在基因打靶方面取得新的進展，使用化學修飾的DNA為供體模板，通過粒子轟擊法將多達2 049個堿基對的序列以25%的效率插入水稻基因組。同時，還報道了一種巧妙的基因替換方法，該方法依賴于同源導向修復、化學修飾的供體DNA和靶位點串聯重復序列的存在，以6.1%的效率實現了高達130 bp序列的替換[62]。

3.3.2 基于堿基編輯技術培育抗除草劑作物 基于CRISPR-Cas9發展而來的堿基編輯系統在創制抗除草劑材料方面發揮了重要作用。單堿基編輯系統元件主要包含nCas9或dCas9與相應的脫氨酶，能夠在不引入DNA雙鏈斷裂也不需要重組修復模板的情況下實現高效、精準的單堿基水平修飾，主要有3種類型：胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE，C-to-T）[63]、腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE，A-to-G）[64]和糖基化酶堿基編輯器（glycosylase base editor，GBE，C-to-G）[65]。LI等[66]利用堿基編輯技術對玉米乙酰乳酸合成酶ZmALS1和ZmALS2基因進行靶向突變，發現目標單堿基雙突變體可以達到并超過轉基因同類產品的抗性水平，除草劑抗性水平達到大田生產推薦上限15倍劑量或一般推薦35倍劑量水平；揚州大學王幼平團隊利用適用于油菜的堿基編輯系統成功對BnALS1基因Pro197進行靶向突變，共獲得BnALS1基因的2種類型（P197F和P197S）突變體，噴施苯磺隆在3倍田間推薦噴施劑量的濃度下均未表現任何藥害癥狀[67]。李家洋團隊通過堿基編輯小麥的乙酰乳酸合成酶和乙酰輔酶A羧化酶基因，生成了具有除草劑耐受性突變的無轉基因小麥種質，賦予對磺酰脲類，咪唑啉酮類和芳氧基苯氧基丙酸酯類除草劑的耐受性[68]。利用腺嘌呤堿基編輯器對小麥的α類tubulin基因Met-268位點進行編輯，成功地獲得了有效耐受二硝基苯胺類除草劑的小麥種質材料[69]。

現有的單堿基編輯器CBE和ABE只能催化單一類型堿基的轉換，不能實現2種類型的同時轉換。2020年，中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞、李家洋課題組將胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ABE7.10同時融合在nCas9的N端，構建了4種形式的新型飽和靶向內源基因突變的雙堿基編輯器STEME-1—STEME-4（saturated targeted endogenous mutagenesis editors），新型雙堿基編輯器可以只在一個sgRNA引導下誘導靶位點C-T和A-G的同時突變，顯著增加了靶基因堿基突變的飽和度及突變類型的多樣性。利用STEME-1系統成功對水稻進行飽和突變，擴大了基因編輯的范圍，成功地創制了抗除草劑材料，同時，也加速了抗除草劑基因的定向進化[70]。

3.3.3 基于Prime-editing系統培育抗除草劑作物 Prime-editing系統是一種基于CRISPR的新型編輯器，在不產生DNA雙鏈斷裂的情況下，無須添加外的供體模板，在活細胞DNA中就可實現幾乎任何替換（substitution）、微小插入（micro insertion）和微小缺失（microdeletion）。該系統包含Cas9-逆轉錄酶（nCas9與逆轉錄酶的融合蛋白）和pegRNA（包含目標序列逆轉錄模板），具有編輯精準、位置靈活、類型多樣等特點，有極為重要的應用潛力[71]。Prime editing系統自被開發利用以來，經歷了多代的優化升級，主要包括使用增強的prime editors效應蛋白[72]、優化改進pegRNAs的設計[73-74]、減少prime editing的副產物，改進DNA修復[75]。其中，pegRNA的設計合理與否對于精準編輯的影響似乎更大。pegRNA的切點選擇、元件長度乃至序列堿基構成都會對prime editing效率造成重大影響。這也暗示在沒有有效指導方法的情況下，植物基因組prime editing系統可能需要構建由不同參數元件組成的pegRNA陣列并加以試驗篩選才可能實現有效編輯（development of a plant prime editing system for precise editing in the rice genome）。對于pegRNAs的設計，高彩霞老師課題組已經開發了高效的pegRNA設計網站PlantPegDesigner（http://www.plantgenomeediting.net/）及脫靶評估系統，為高效PE系統的應用奠定基礎[76]。另一方面，在pegRNA設計方面效果比較好的是通過在pegRNA的3′末端添加RNA motifs，一方面可以對3′進行保護，另一方面可以阻礙pegRNA的降解，這種策略將PE的編輯效率提升到原來的3—4倍[74]。目前，已有研究利用prime-editing系統對進行定向氨基酸替換，創制了具有咪唑啉酮和雙草醚抗性的水稻材料[43, 45]。通過刪除M-MLV-RT的RNase H結構域或在M-MLV-RT的N端融合病毒核衣殼蛋白（nucleocapsid，NC），開發出了升級版新型引導編輯器ePPE，成功創制了可抗甲咪唑煙酸和煙嘧磺隆2種除草劑的水稻新材料[77]。中國農業大學陳其軍課題組在玉米中測試了3種優化策略的PE系統，結果表明，優化的PE能夠高效誘導產生可遺傳的純合和雜合玉米突變株系，為培育抗除草劑玉米品種奠定了基礎[78]。基于PE系統的不斷優化與改造，將為基因編輯工具的開發以及抗除草劑種質的創制提供穩固的技術支持。

綜上，在以上所描述的利用生物技術創制抗除草劑作物的類型中，抗ALS抑制類的除草劑作物材料最豐富，在水稻、小麥、玉米、油菜和煙草等均有相關報道（表1）。

4 機遇與挑戰

目前，我國采用化學除草的面積已達到播種面積的60%，基本上形成了以化學藥劑防除為主的田間雜草防除技術體系[99]。轉基因作物自1996年開始商業化種植以來，全球轉基因作物的種植面積總體上呈逐年攀升趨勢。2019年全球轉基因作物種植面積超過1.9億hm2，是1996年種植面積170萬hm2的112倍。抗除草劑是轉基因大豆、油菜、玉米、苜蓿和棉花的主要性狀，單一抗除草劑轉基因作物的種植面積為8 150萬hm2，約占全球轉基因作物種植面積的43%，這就意味著抗除草劑作物有著巨大的市場發展潛力與占有率[100]。

隨著除草劑的大面積使用，抗性雜草的產生是當前化學防治雜草面臨的主要挑戰，培育復合抗除草劑作物、優化除草劑配套使用方法是解決該問題的有效途徑。同時，基因逃逸以及環境安全問題也是面臨的一個重要挑戰。如果一些作物的近緣種植株獲得了抗除草劑基因而變成了“超級雜草”，或者是農民為了快速達到消除雜草的目的加大藥劑的使用量，甚至是隨意丟棄廢棄的農藥包裝，都將會對農田雜草的防治、環境安全帶來新的難題。基于此，研制開發一種新型安全的生物型除草劑及其抗除草劑作物系統將有助于問題的解決。

CRISPR-Cas系統與誘變育種相比可節省大量的人力物力，且更高效和精準。相較于轉基因作物，目前，已經有國家逐漸出臺了對于基因編輯作物的監管政策，相較于對轉基因作物的嚴格管控，美國監管機構對基因編輯作物的態度相對“溫和”，讓人感到欣喜的是經基因編輯的西紅柿和魚已經正式在日本上市。對于抗除草劑作物的創制，結合已有的研究表明，大多數抗除草劑作物的作用機理主要是某一位點的氨基酸發生特定突變，導致與除草劑的結合活性降低，基于CRISPR-Cas9系統發展的堿基編輯技術和Prime editing技術在創制抗除草劑作物上就作出了重要貢獻，創制了不同類型的單抗除草劑材料，以及具有復合性狀的多抗除草劑材料。同時，CRISPR-Cas系統也存在著一些局限性，主要包括（1）PAM位點的限制：目前，常用的Cas9和Cas12a主要識別的PAM是NGG和TTTV，但是針對一些特定的除草劑突變位點卻沒有合適的PAM，因此，就需要開發一些無PAM限制的Cas變體，拓寬全基因組編輯的范圍；（2）轉化受體材料和轉化方法的限制：目前，植物中常用的轉化系統包括農桿菌介導法、基因槍轟擊法及PEG轉化法（polyethylene glycol，PEG），其中，農桿菌介導法是最成熟的轉化途徑，但由于宿主范圍的限制，只適用于部分植物物種。對于受體材料具有較強的基因型的差異，如：在棉花中只有JIN668、YZ-1和中棉24具有較強的再生能力，其余的棉花種質例如海島棉則難再生，限制了基因編輯的廣泛應用；（3）脫靶問題：基因編輯工具除了要具備高效性之外，還應具有一定的精準性，盡可能提高DNA識別的特異性，減少在全基因組范圍內的脫靶；（4）原創性以及專利問題：在我國科學研究中所使用的基因編輯技術體系，其相關核心專利大都掌握在歐美相關研究機構和公司手中，博德研究所的張峰團隊已經申請了CRISPR/Cas9的專利，未來我國如果要利用其進行分子育種、醫療診斷等商業化應用的話，存在被“卡脖子”的巨大風險。但目前隨著基因組學、結構生物學、宏基因組學、生物信息學的快速發展，基因編輯技術也在以前所未有的態勢不斷發展，新型的基因編輯工具不斷被發掘，基因編輯技術將為抗除草劑作物的培育提供更多的技術手段。

表1 基于基因編輯培育抗除草劑作物

HDR：同源重組修復；NHEJ：非同源末端連接；ABE：腺嘌呤堿基編輯；CBE：胞嘧啶堿基編輯

HDR: homology-directed repair; NHEJ: Non-homologous end joining; ABE: adenine base editing; CBE: cytidine base editing

5 展望

目前，抗除草劑作物的種植一方面減少了勞動力和財力的投入，降低了生產成本，另一方面，這也促進了規模化與機械化的發展，為大規模、集約化的現代化農場的建設創造了條件。但隨之而來的是除草劑的大量施用和抗除草劑作物大面積推廣，導致雜草對除草劑抗性，更有甚者部分雜草對多種除草劑產生了多重抗性，這就為雜草管理和抗除草劑作物的發展提出了新的挑戰。針對這一挑戰，需要進行科學的雜草管理、合理的種植制度、挖掘與現有除草劑沒有交叉抗性的新型除草劑基因并研究其作用模式、借助轉基因技術及基因編輯技術創制滿足生產需要的抗除草劑新種質[101]。尋找新型的生物除草劑及其抗性基因與作用機制也是未來一個重要的發展方向，這樣既能夠最大限度地發揮現有除草劑的經濟效益，也能優化現有的雜草防治體系和普及保水、保土及低投入的少耕、免耕、密植的耕種模式，同時優化抗除草劑作物的種植方式。此外，基于環境友好與可持續性的考慮（綠水青山就是金山銀山），就要求新型除草劑應該具有高效，可持續，安全無公害和適應環境等特性。現在，也出現了一些解決這些問題的方法。如：基于抗性基因導向方法挖掘新型作用機制的除草劑系統的方法[16]；綜合運用生物信息學、分子生物學和藥理學的方法為發現除草劑原始靶標提供了便利。基于這些方法，還開發出一些新型除草劑標靶基因，如：SPS、HST、DHODH、FAT和DHAD等[102]。目前，全球已經成功商業化或正式獲得登記的生物除草劑產品已經有20余種[21]。其中利用生物活體的生物除草劑類型，由于需要較為嚴格的環境條件才能起作用，限制了其應用。這些問題的解決均有賴于功能基因組學研究、生物基因工程技術和生產工藝的創新[3]。因此，為了克服生物除草劑產品發展的成本與環境制約因素，應加大力度研制和發展生物除草劑生產工藝、新劑型及應用技術。

轉基因技術與基因編輯技術是創制抗除草劑材料的2種最優方法，但兩者之間存在著本質的區別。基因編輯作物育種用于編輯作物內源基因，且后代可分離出外源調控基因序列，經過連續多代分離后可以獲得完全不含外源基因、且具有目的性狀的目標材料。面對基因編輯技術所存在的一些限制性問題，目前也有了一些應對措施，例如，目前已經挖掘了一些Cas蛋白的變體，既可以拓寬基因組編輯的范圍，又具有高效的靶向特異性，如xCas9[103]、Cas9-NG[104]、SpRY[105]、SpG[106]、ttLbCas12a[107]和enAsCas12a[108]等；轉化受限于基因型的植物，一方面可以運用納米顆粒，或病毒載體進行基因編輯元件的遞送方法打破基因型限制，目前在煙草[109]、小麥[110]、甘薯[111]中均有相關報道；另一方面，通過利用一些再生因子提高轉化的效率，比如BBM、WUS等關鍵再生因子[112]；在原創性的基因編輯工具挖掘方面我國也取得了一定的進步，中國農業大學的賴錦盛教授利用生物信息學成功挖掘到一種新的CRISPR/Cas12j基因編輯系統。目前，各國對于基因編輯技術的監管問題也不盡相同。2022年1月24日，中國農業農村部制定公布了《農業用基因編輯植物安全評價指南（試行）》，主要針對沒有引入外源基因的基因編輯植物，依據可能產生的風險申請安全評價。這對我國基因編輯技術從業者將是一個極大鼓舞。對于我國生物育種技術研發與產業推動意義重大。

基因編輯技術對于我國的作物改良具有重要的推動作用，體現在作物的高產、抗逆、單倍體誘導、品質改良等一系列角度，這對于抗除草劑作物的發展也將是里程碑式的。相信在后基因組時代，伴隨著基因編輯技術以及多種組學的發展，我國的抗除草劑育種將迎來一個嶄新的時代。

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Opportunities and challenges for developing herbicide-resistance crops in the post-genomic era

WU YuanLong1, HUI FengJiao2, PAN ZhenYuan1, YOU ChunYuan3, LIN HaiRong1, LI ZhiBo1, JIN ShuangXia2, NIE XinHui1

1Agricultural College, Shihezi University/Key Laboratory of Oasis Ecology Agriculture, Xinjiang Production and Construction Corps, Shihezi 832003, Xinjiang;2College of Plant Sciences & Technology, Huazhong Agricultural University/National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Wuhan 430070;3Cotton Research Institute of Shihezi Academy of Agricultural Sciences, Shihezi 832011, Xinjiang

Global agriculture is facing severe challenges, and breeding technology is the foundation and key to the development of the seed industry. Gene editing technology refers to the precise modification of target genes to achieve deletion, insertion, and replacement of specific target gene fragments. It can precisely modify target genes or introduce certain excellent genes into crops to produce crops with excellent agronomic traits, which has great potential in molecular design breeding and is of great significance to ensuring food security. Weed damage has a huge impact on the yield and quality of crops. To control weed damage efficiently, safely and sustainably has always been a hot research topic. Currently, more than 200 types of chemical herbicides have emerged in the global market. Using chemical methods to control weeds has become an important part of modern agriculture, and the cost of weed control has been significantly reduced by promoting herbicide-resistant crops. However, with the large-scale promotion of herbicide-resistant crops and the long-term use of single herbicides, environmental safety problems such as weed resistance and escape of resistant genes have gradually been discovered. Currently, the development of functional genomics, bioinformatics and genetic engineering technology (especially the widespread application of gene editing technology in plants) has created conditions for the creation of herbicide-resistant crops and new efficient weed control systems. In this article, the main target genes of herbicides that inhibit amino acid biosynthesis, lipid metabolism, carotenoid, plastoquinone and tocopherol biosynthesis pathways and their action mechanisms are introduced at first. Secondly, two methods for mining new herbicide resistance genes and herbicide systems are introduced, including the directed mutation method of herbicide resistance genes within crops based on CRISPR/Cas system and the resistance gene guidance method based on the co-evolution theory of natural product and organisms in nature. Moreover, the research progress of three breeding methods for herbicide resistant crops was reviewed, including conventional breeding, transgenic breeding and CRISPR/Cas genome editing based breeding. Among them, the research progress of CIRSPR/Cas system, base editing technology, and prime editing system in cultivating herbicide resistant crops were highlighted. The main challenge faced by chemical control of weeds and herbicide resistant crops is resistant weeds and environmental safety issues, and gene escape, respectively. At present, the rapid development of genome editing technology provides new solutions and new opportunities for the development of herbicide resistant crops in the post genome era. Finally, the prospects for the future of herbicide-resistant crops were provided.

gene editing technology; herbicides; herbicide-resistant genes; breeding of herbicide-resistant crops

2023-05-03；

2023-06-25

兵團科技創新人才計劃-科技特派員（S2019CB1877）、兵團科技創新人才計劃-強青（2021CB028）、石河子大學青年創新拔尖人才計劃-拔尖人才（CXBJ202208）

吳元龍：wyl19880322@163.com。惠鳳嬌：17806278731@163.com。吳元龍和惠鳳嬌為同等貢獻作者。通信作者金雙俠，E-mail：jsx@mail.hzau.edu.cn。通信作者聶新輝，E-mail：xjnxh2004130@126.com

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.005

（責任編輯 李莉）