柚果肉顏色遺傳變異分析及候選基因挖掘

程莉，楊勝男，朱延松，王旭，趙婉彤，李仁靜，李沛，苑忠杰，江東

柚果肉顏色遺傳變異分析及候選基因挖掘

程莉，楊勝男，朱延松，王旭，趙婉彤，李仁靜，李沛，苑忠杰，江東

西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712

【目的】果肉顏色是柚類品種重要的外觀性狀以及品質(zhì)性狀，挖掘與柚果肉顏色顯著相關(guān)的變異位點(diǎn)及相關(guān)基因，為進(jìn)一步理解柚類品種果肉呈色機(jī)理以及分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。【方法】通過(guò)表型調(diào)查及色差儀測(cè)量，對(duì)100份柚類種質(zhì)的果肉顏色進(jìn)行評(píng)價(jià)和分類，利用GBS（genotyping-by-sequencing）測(cè)序技術(shù)對(duì)所有材料進(jìn)行簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。將測(cè)序得到的基因型數(shù)據(jù)通過(guò)GCTA軟件計(jì)算特征值及特征向量分析群體結(jié)構(gòu)，利用plink 2.0軟件計(jì)算不同果肉顏色群體的遺傳分化系數(shù)（Fst），選用GEMMA軟件中GLM模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，選取與顏色表型顯著關(guān)聯(lián)的變異位點(diǎn)進(jìn)行等位變異分析，根據(jù)柑橘LD大小對(duì)變異位點(diǎn)鄰近位置進(jìn)行基因注釋，篩選出與果肉顏色形成相關(guān)的候選基因，隨機(jī)選擇4份白肉柚和4份紅肉柚材料在不同發(fā)育時(shí)期對(duì)候選基因表達(dá)進(jìn)行初步驗(yàn)證。【結(jié)果】根據(jù)果肉顏色將100份柚類種質(zhì)分為白肉柚和紅肉柚兩大類，其中包含58份白肉柚和42份紅肉柚。通過(guò)Fst遺傳分化指數(shù)分析和GWAS全基因組關(guān)聯(lián)分析共篩選到Fst系數(shù)大于0.4且-log10（P）＞9的位點(diǎn)6個(gè)，對(duì)6個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行基因分型，根據(jù)基因型能夠預(yù)測(cè)柚品種的果肉顏色。對(duì)變異位點(diǎn)側(cè)翼25 kb序列進(jìn)行基因注釋共篩選出14個(gè)基因，其中包含類異戊二烯合成、葉綠體氧化還原反應(yīng)、質(zhì)體發(fā)育、脫落酸信號(hào)調(diào)節(jié)、乙烯響應(yīng)等相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子?；虮磉_(dá)分析顯示，（促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶MAPKKK17）、（葉綠體卟啉原脫氨酶）、（轉(zhuǎn)錄因子TCP7）、（葉綠體超氧化物歧化酶SOD3）、（FAD合成酶2）與果肉顏色形成存在一定關(guān)聯(lián)?！窘Y(jié)論】經(jīng)過(guò)GWAS和Fst兩種分析方式共鑒定到6個(gè)與果肉顏色顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，對(duì)該位點(diǎn)上下游25 kb的距離進(jìn)行基因注釋共篩選到了14個(gè)基因，通過(guò)基因表達(dá)模式分析初步判定其中5個(gè)基因參與了柚果肉顏色的形成。

柚；果肉顏色；Fst；關(guān)聯(lián)分析；候選基因

0 引言

【研究意義】柚是蕓香科柑橘屬植物的一個(gè)基本種，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的生物進(jìn)化和栽培育種形成了豐富多樣的種質(zhì)資源[1-2]，對(duì)現(xiàn)有資源進(jìn)行鑒定、評(píng)價(jià)、分析和利用對(duì)于柚類育種改良具有重要意義。隨著我國(guó)柚類產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和消費(fèi)需求的多樣化，對(duì)于柚類品種的果實(shí)品質(zhì)要求不斷提高。果肉顏色是柚類品種重要的品質(zhì)性狀之一，在長(zhǎng)期的栽培育種和人為選擇過(guò)程中，產(chǎn)生了果肉顏色豐富的變異材料[3]。近年來(lái)，研究者們?cè)诮馕龉獬噬珯C(jī)理上已經(jīng)做了大量工作，包括柚在內(nèi)的柑橘屬植物果實(shí)呈色的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因已十分清晰[4]。但由于柑橘果樹(shù)童期長(zhǎng)、雜交群體占地面積大、遺傳背景復(fù)雜、可利用的分子標(biāo)記較少等多因素影響[5-7]，對(duì)于果實(shí)顏色的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和相關(guān)基因還知之甚少，且通過(guò)構(gòu)建遺傳雜交群體來(lái)對(duì)果肉顏色的相關(guān)調(diào)控因子進(jìn)行精細(xì)挖掘及定位耗時(shí)長(zhǎng)且難度大[8-9]。因此，本研究利用國(guó)家柑橘種質(zhì)資源圃（重慶）中保存的豐富柚類資源，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合關(guān)聯(lián)分析和群體遺傳分化分析兩種方式，以挖掘與果肉呈色顯著關(guān)聯(lián)的變異位點(diǎn)和相關(guān)基因，為理解果肉顏色這個(gè)復(fù)雜的表型性狀提供思路，進(jìn)一步為分子標(biāo)記輔助育種和柚果肉顏色改良提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】果實(shí)顏色的形成是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程[10]，包含柚在內(nèi)的柑橘屬植物，果實(shí)著色主要涉及到葉綠素、類胡蘿卜素和花青素3大類，3類色素化合物的成分和比例是決定果實(shí)呈色的關(guān)鍵指標(biāo)[11-13]。在柚類品種中，除紫皮柚[14-15]外，鮮有果實(shí)在成熟過(guò)程中存在花青素沉著現(xiàn)象，絕大多數(shù)果實(shí)顏色形成受葉綠素和類胡蘿卜素的影響。類胡蘿卜素的合成、降解以及在質(zhì)體中的儲(chǔ)藏水平均會(huì)影響類胡蘿卜素的積累，進(jìn)而導(dǎo)致不同果肉顏色的呈現(xiàn)[16]。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展、測(cè)序成本的逐漸降低，對(duì)于果實(shí)著色的研究已從對(duì)合成通路上結(jié)構(gòu)基因的功能解析發(fā)展到挖掘更多調(diào)控因子。Minamikawa等[17]通過(guò)二代測(cè)序分析了787份柑橘材料，發(fā)現(xiàn)在chr 2、chr 4、chr 6上均存在與果皮和果肉顏色顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，且與僅有17 kb的距離。王霞[18]利用191份柚類資源對(duì)果肉顏色進(jìn)行了GWAS關(guān)聯(lián)分析，確定在7號(hào)染色體上存在顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】果實(shí)顏色代謝相關(guān)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵基因有待研究。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)Fst分析及GWAS關(guān)聯(lián)分析方法鑒定與柚果肉顏色形成顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，確定果肉顏色形成的關(guān)鍵基因，為柚的品質(zhì)改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年5月至2023年2月在西南大學(xué)/中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所進(jìn)行，所用100份柚類種質(zhì)材料均來(lái)自于國(guó)家柑橘種質(zhì)資源圃（重慶），材料名稱見(jiàn)表1。

表1 100份柚果肉顏色統(tǒng)計(jì)

續(xù)表1 Continued table 1

1.1 果肉顏色鑒定

在果實(shí)成熟期，每份材料采集3個(gè)大小均勻的柚果進(jìn)行顏色統(tǒng)計(jì)并拍照記錄，白色果肉表型記為A，紅色果肉表型記為B。使用colormeter pro手持色差儀測(cè)定果實(shí)橫切面L（亮度）、a（從紅色至綠色的范圍）、b（從紅色至綠色的范圍）數(shù)值，每份材料重復(fù)測(cè)定3次，每個(gè)橫切面重復(fù)測(cè)定4次。運(yùn)用飽和度C=(a2+b2)1/2，色差值CI=1000×a/(L×C)對(duì)果肉顏色進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2 全基因組測(cè)序

將采集的100份柚春梢葉片用75%酒精擦拭干凈，采用改良CTAB法提取基因組DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND_1000分光光度計(jì)進(jìn)行DNA濃度和質(zhì)量檢測(cè)。將所有通過(guò)質(zhì)檢的樣品委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行GBS簡(jiǎn)化基因組測(cè)序。測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)base calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)raw data，raw data經(jīng)fastp軟件質(zhì)控后比對(duì)到柚參考基因組（https:// www.citrusgenomedb.org/analysis/187），采用GATK- HaplotypeCaller和Samtools軟件提取測(cè)序結(jié)果中的多態(tài)性SNP位點(diǎn)，設(shè)置dp 5、Miss 0.2、maf 0.01的條件參數(shù)進(jìn)行過(guò)濾，最后得到包含100份材料高質(zhì)量SNP數(shù)據(jù)的vcf文件用作后續(xù)分析。

1.3 主成分分析

用GCTA軟件（http://cnsgenomics.com/software/ gcta/）計(jì)算特征值及特征向量進(jìn)行主成分分析，R軟件中的ggplot2程序包將結(jié)果可視化。

1.4 優(yōu)異變異位點(diǎn)篩選

遺傳分化指數(shù)Fst可用于評(píng)價(jià)群體間的分化程度[19]。將測(cè)序得到的vcf文件通過(guò)plink軟件轉(zhuǎn)換為二進(jìn)制bed文件，根據(jù)紅肉柚和白肉柚的表型分組文件逐位點(diǎn)計(jì)算群體間的遺傳分化系數(shù)Fst，利用R軟件中的ggplot2程序包進(jìn)行可視化，合理設(shè)置閾值，篩選Fst指數(shù)較大的位點(diǎn)用于后續(xù)分析。

全基因組關(guān)聯(lián)分析GWAS能夠?qū)⒈硇蛿?shù)據(jù)和高通量測(cè)序結(jié)果關(guān)聯(lián)分析，從而鑒定與目標(biāo)性狀相關(guān)的變異位點(diǎn)。使用GEMMA軟件（https://gitee. com/khjia/GEMMA）中的GLM模型進(jìn)行柚果肉顏色關(guān)聯(lián)分析，根據(jù)分析結(jié)果合理設(shè)置閾值，統(tǒng)計(jì)-log10(P)較大的位點(diǎn)并利用qqman程序包繪制manhattan-plot。

1.5 候選基因預(yù)測(cè)及初步驗(yàn)證

通過(guò)Fst計(jì)算結(jié)果以及GWAS關(guān)聯(lián)分析結(jié)果兩種方式篩選優(yōu)異變異位點(diǎn)，將變異位點(diǎn)側(cè)翼25 kb序列用柑橘基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.citrusgenomedb. org/）和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）進(jìn)行基因注釋，結(jié)合前人研究以及基因功能注釋結(jié)果篩選出候選基因。為驗(yàn)證候選基因與果肉顏色形成的關(guān)系，將候選基因的CDS序列上傳到NCBI（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome）網(wǎng)站進(jìn)行熒光定量PCR（qPCR）引物設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表2。隨機(jī)選擇4份白肉柚（衛(wèi)寺蜜柚、通賢柚、左氏柚、墊江白柚）和4份紅肉柚（墊江紅心雜種3號(hào)、平陽(yáng)柚、菊花芯柚、江津紅心柚）用作驗(yàn)證材料。采集果實(shí)膨大期（S1）、轉(zhuǎn)色期（S2）、成熟期（S3）3個(gè)時(shí)期的柚果，對(duì)其顏色參數(shù)a、b及色差值CI進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，取適量果肉于液氮中充分研磨，用Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取果肉RNA，用Hifair? III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，用Hieff UNICON? Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix進(jìn)行熒光定量。選擇為內(nèi)參基因，用2-△△CT計(jì)算候選基因相對(duì)表達(dá)水平，GraphPad Prism軟件作圖分析。

表2 qPCR相關(guān)引物核苷酸序列

2 結(jié)果

2.1 果肉顏色鑒定

經(jīng)過(guò)調(diào)查統(tǒng)計(jì)，100份柚類種質(zhì)資源中有58份材料為白肉柚，42份材料為紅肉柚。色差測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，白肉柚色差指數(shù)CI介于-3.27—65.00，顏色變異系數(shù)為73.21%；紅肉色差指數(shù)CI介于18.37—65.00，顏色變異系數(shù)為27.38%。以飽和度C為橫坐標(biāo)，色差值CI為縱坐標(biāo)繪制散點(diǎn)圖（圖1），可見(jiàn)白肉群體被聚為一類，紅肉群體聚集為一類。

2.2 主成分分析

經(jīng)過(guò)GBS測(cè)序后獲得大量SNP位點(diǎn)，過(guò)濾篩選后共得到包含100份材料的121 726個(gè)高質(zhì)量SNP數(shù)據(jù)?；谶^(guò)濾后的SNP位點(diǎn)主成分分析結(jié)果顯示（圖2），100份材料中紅肉和白肉群體沒(méi)有明顯的群體分層現(xiàn)象，表明紅肉和白肉柚類品種群之間并不存在明顯的遺傳差異。若群體之間產(chǎn)生分層，則說(shuō)明群體間存在太多的遺傳差異，則不利于性狀的關(guān)聯(lián)分析和基因定位。因而果肉顏色這個(gè)數(shù)量性狀可以利用100份柚類自然資源群體進(jìn)行表型和基因型的關(guān)聯(lián)分析。

2.3 優(yōu)異變異位點(diǎn)篩選

為挖掘白肉柚與紅肉柚群體果肉顏色的變異情況，根據(jù)紅肉柚（58）和白肉柚（42）表型分組用plink軟件進(jìn)行全基因掃描得到Fst值，閾值設(shè)置為0.4。Fst結(jié)果顯示（圖3），利用白肉和紅肉兩種表型鑒定到的遺傳分化指數(shù)最大位點(diǎn)均分布在chr 7上，且數(shù)值達(dá)到0.4以上，而已有研究表明Fst指數(shù)大于0.25即說(shuō)明群體間存在明顯分化[19]。這表明白肉柚群體和紅肉柚群體在該位點(diǎn)存在明顯的分化現(xiàn)象，且與果肉顏色性狀高度相關(guān)。高于閾值線的6個(gè)SNP位點(diǎn)可用于揭示表型性狀的變異關(guān)系，詳細(xì)信息見(jiàn)表4。

表3 100份柚類種質(zhì)果肉色差CI變化分布及分布特征

圖1 100份柚類種質(zhì)的果肉色差值散點(diǎn)圖

圖2 100份柚主成分分析圖

表4 Fst計(jì)算獲得的6個(gè)SNP位點(diǎn)信息

圖3 白肉柚和紅肉柚群體Fst分析

選用一般線性模型GLM進(jìn)行GWAS關(guān)聯(lián)分析，閾值設(shè)置為-log10(P)=9。曼哈頓圖（圖4-A）顯示，與果肉顏色關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)共12個(gè)（表5），均位于7號(hào)染色體上，而Q-Q plot（圖4-B）結(jié)果顯示前半部分與觀測(cè)值一致，后半部分微微上翹，說(shuō)明高出期望值的位點(diǎn)可能與果肉顏色相關(guān)。

圖4 利用100份柚果肉顏色進(jìn)行GWAS關(guān)聯(lián)分析

經(jīng)過(guò)Fst遺傳分化分析以及GWAS全基因組關(guān)聯(lián)分析兩種方式發(fā)現(xiàn)在chr 7上存在Fst＞0.4且-log10(P)＞9的相同變異位點(diǎn)6個(gè)，分別是SNP01: 15825706、SNP02: 15987387、SNP03: 15795993、SNP04: 15755408、SNP05: 15744770、SNP06: 16111951。6個(gè)SNP在的基因型分別是：A/C、C/T、C/T、C/T、G/A、C/T，其等位分析顯示（圖5），SNP01中基因型為AA的28份材料全部為白肉，基因型為CC的材料中果肉顏色呈紅色的占87%，而基因型為AC的材料有65%果肉為白色；SNP02中基因型為CC和CT的大部分材料果肉顏色為白色，而基因型為T(mén)T的紅肉材料有38份，占所有紅肉材料的90%；SNP03基因型中CC基因型只有2份材料為白肉，CT和TT基因型則只有少數(shù)材料為紅肉；SNP04中基因型為CT和TT的材料絕大部分果肉為白色，而基因型為CC的材料中，有82%為紅色；SNP05中基因型為GG的材料果肉全部為白色，而GA基因型材料中，95%果肉為白色，AA基因型中有41份材料為紅肉，僅有1份紅肉材料非AA基因型；SNP06中CC基因型材料全部為白色果肉，CT基因型材料中有84%為白肉，TT基因型材料中有39份材料果肉呈紅色，占所有紅肉材料比例的93%。以上結(jié)果表明，6個(gè)SNP與果肉顏色存在不同程度的關(guān)聯(lián)，與其關(guān)聯(lián)的候選基因可能參與果肉顏色形成。

表5 GWAS分析獲得的12個(gè)SNP位點(diǎn)信息

圖5 100份柚類種質(zhì)6個(gè)SNP基因型的分析

2.4 候選基因預(yù)測(cè)及初步驗(yàn)證

根據(jù)類胡蘿卜素合成代謝途徑相關(guān)基因的調(diào)控研究及變異位點(diǎn)臨近基因的功能注釋信息，篩選到14個(gè)基因作為果肉顏色形成的候選基因（表6）。為進(jìn)一步驗(yàn)證候選基因是否參與果肉顏色形成，分別選取4個(gè)白肉柚材料和4個(gè)紅肉柚材料3個(gè)發(fā)育時(shí)期的果實(shí)進(jìn)行熒光定量分析，果肉呈色情況及顏色指數(shù)變化分別見(jiàn)圖6和圖7，隨著果實(shí)發(fā)育成熟，白肉和紅肉果肉顏色差異逐漸明顯，白肉柚在整個(gè)發(fā)育過(guò)程其a值和色差值變化不大，而紅肉柚的a值和色差值隨果肉顏色加深而顯著升高。

表6 14個(gè)候選基因注釋信息

將14個(gè)基因在柚類果實(shí)的不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行熒光定量分析（圖8）。在白肉品種總體呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，尤其在S2時(shí)期表達(dá)量較高，而在4個(gè)紅肉材料中無(wú)明顯表達(dá)差異。和隨著果實(shí)轉(zhuǎn)色成熟，大體呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，在S2及S3時(shí)期紅肉材料相對(duì)白肉材料平均相對(duì)表達(dá)更高，在S2時(shí)期白肉的‘衛(wèi)寺蜜柚’和‘左氏柚’的表達(dá)量顯著提高。在4個(gè)白肉柚中呈現(xiàn)先增高后下降的趨勢(shì)，在4個(gè)紅肉柚中呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，總體上看，白肉柚材料的表達(dá)量相對(duì)較高。在S2、S3時(shí)期表達(dá)量較高，但在兩種果肉表型材料中無(wú)明顯表達(dá)差異。在S1時(shí)期的白肉材料中表達(dá)量顯著低于紅肉材料，總體來(lái)看，該基因在兩種果肉顏色柚果中無(wú)明顯差異。在成熟過(guò)程中總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，但在兩種顏色果肉材料中表達(dá)趨勢(shì)無(wú)明顯規(guī)律。在紅肉品種中的表達(dá)量均很低。在白肉材料中表達(dá)高于紅肉材料，在S1時(shí)期及S3時(shí)期差異更顯著。大體呈現(xiàn)先增后減的規(guī)律，但在兩種果肉表型材料中的表達(dá)趨勢(shì)無(wú)明顯規(guī)律。在試驗(yàn)材料中均呈現(xiàn)先增后減的表達(dá)規(guī)律，且在S1、S2、S3三個(gè)時(shí)期白肉品種的表達(dá)量顯著高于紅肉品種。在兩種顏色果肉材料中表達(dá)趨勢(shì)無(wú)明顯規(guī)律。在S1時(shí)期白肉中的表達(dá)量較高于紅肉，但總體來(lái)看，在整個(gè)發(fā)育過(guò)程，該基因在兩種材料中無(wú)明顯的表達(dá)差異。在兩種顏色果肉材料中表達(dá)趨勢(shì)無(wú)明顯規(guī)律。綜上，推測(cè)、、、、參與果肉顏色形成。

S1：膨大期；S2：轉(zhuǎn)色期；S3：成熟期。下同 S1: The expansion period; S2: The turning period; S3: The mature period. The same as below

圖7 候選基因驗(yàn)證所用材料果肉顏色參數(shù)變化

每個(gè)基因均以‘衛(wèi)寺蜜柚’S1時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量為1。編號(hào)所指的品種同表1

The expression level of each gene in Wei Si Honey pomelo S1 period was set as 1. The cultivar indicated by the code is the same as table 1

圖8 14個(gè)基因在4個(gè)紅肉和4個(gè)白肉柚種質(zhì)果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量

Fig. 8 The relative expression of 14 genes in 4 red and 4 white pulp of pomelo accessions at different fruit development stages

3 討論

我國(guó)是柚生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó)，果實(shí)品質(zhì)是柚在市場(chǎng)上競(jìng)爭(zhēng)的重要因素[20]。果肉顏色不僅是柚重要的外觀品質(zhì)，也是人們?cè)u(píng)判其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的重要參考指標(biāo)[21]。在現(xiàn)有的柚類群體中，產(chǎn)生了眾多紅色果肉的表型變異品種，因其亮麗的顏色和豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值受到消費(fèi)者青睞和育種工作者的關(guān)注，因此，豐富果肉顏色對(duì)于柚的品種改良具有非常重要的意義。

3.1 群體結(jié)構(gòu)分析

本研究從果肉色差和GBS測(cè)序結(jié)果分析了100份柚類種質(zhì)的紅肉和白肉兩種呈色現(xiàn)象，并對(duì)其進(jìn)行了群體結(jié)構(gòu)劃分。根據(jù)果肉色差測(cè)定結(jié)果可見(jiàn)白肉柚和紅肉柚存在明顯的聚類現(xiàn)象；而利用測(cè)序得到的SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析發(fā)現(xiàn)，白肉柚和紅肉柚群體結(jié)構(gòu)較為混雜，沒(méi)有明顯的分層現(xiàn)象，可能是本研究所用SNP數(shù)據(jù)較多，無(wú)法將兩個(gè)群體顯著地區(qū)分。

3.2 變異位點(diǎn)分析

果肉顏色作為一個(gè)復(fù)雜的品質(zhì)性狀，受外界條件和遺傳因子綜合作用[22]。盡管果肉呈色的主要色素類胡蘿卜素的代謝通路已非常清晰，但作為一個(gè)由多個(gè)基因共同決定的性狀，類胡蘿卜素的積累不僅受其結(jié)構(gòu)基因影響，其他激素代謝以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控等均有可能影響類胡蘿卜素相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而影響色素的積累[23]。在前人的研究中，利用191份柚共定位了4個(gè)SNP位點(diǎn)與果肉顏色相關(guān)，其中2號(hào)染色體上1個(gè)，7號(hào)染色體上2個(gè)，9號(hào)染色體上1個(gè)[18]。鄔慶江[24]通過(guò)白肉柚和紅肉柚雜交父母本及子代群體對(duì)關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，但發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)BSA重測(cè)序的結(jié)果與王霞的結(jié)果無(wú)重疊關(guān)聯(lián)區(qū)間?；诖?，利用自然群體對(duì)于果肉顏色表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)位點(diǎn)驗(yàn)證和候選基因挖掘仍顯得十分重要。本研究通過(guò)紅肉和白肉兩種材料共定位到位于7號(hào)染色體上的6個(gè)SNP位點(diǎn)，與王霞[18]結(jié)果基本相符，且在變異位點(diǎn)上游發(fā)現(xiàn)直接參與類胡蘿卜素代謝的基因。通過(guò)對(duì)6個(gè)變異位點(diǎn)的等位變異分析發(fā)現(xiàn)，這些位點(diǎn)的不同基因型可以用于果肉呈色的判斷。

3.3 候選基因預(yù)測(cè)

對(duì)顯著關(guān)聯(lián)位點(diǎn)鄰近區(qū)域進(jìn)行注釋后篩選了14個(gè)基因作為候選基因，經(jīng)過(guò)基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，（促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶MAPKKK17）、（膽色素原脫氨酶PBGD）、（轉(zhuǎn)錄因子TCP7）、（超氧化物歧化酶SOD3）、（FAD合成酶2）5個(gè)基因的表達(dá)模式與果肉著色存在顯著關(guān)聯(lián)。MAPKKK17是蛋白質(zhì)磷酸化信號(hào)通路中的重要激酶，參與植物生物和非生物脅迫[25]，研究證明MAPKKK17級(jí)聯(lián)途徑參與ABA的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[26]，而類胡蘿卜素的降解產(chǎn)物可作為ABA合成的前體物質(zhì)[27]，結(jié)合定量分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MAPKKK17在紅肉材料中較白肉材料高表達(dá)，推測(cè)其參與了果肉顏色的形成。果肉的呈色由葉綠素和類胡蘿卜素等的含量和成分決定，葉綠素和類胡蘿卜素之間存在相互協(xié)調(diào)影響的關(guān)系[28]，與葉綠素合成、降解相關(guān)基因的表達(dá)對(duì)類胡蘿卜素的積累能產(chǎn)生一定影響[29]。膽色素原脫氨酶PBGD位于葉綠素合成通路上游，是葉綠素合成途徑中的關(guān)鍵酶之一[30]。在本研究中，PBGD所編碼的基因在果實(shí)成熟過(guò)程中的表達(dá)量先增后減，且白肉組織中表達(dá)量相對(duì)紅肉較高，推測(cè)其通過(guò)控制葉綠素的合成影響了葉綠素與類胡蘿卜素的占比關(guān)系進(jìn)而影響到果實(shí)著色。TCP轉(zhuǎn)錄因子是一類參與植物眾多生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的轉(zhuǎn)錄因子，前人發(fā)現(xiàn)參與柑橘果實(shí)成熟過(guò)程，超表達(dá)番茄植株較野生型植株轉(zhuǎn)色提前[31-32]。本研究中，在白肉材料中較紅肉材料高表達(dá)，初步判斷其參與了果實(shí)著色過(guò)程。超氧化物歧化酶具有抗氧化作用，研究表明，擬南芥中SOD2和SOD3可充當(dāng)葉綠體活性氧消除劑，介導(dǎo)葉綠體的早期發(fā)育[33]。在白肉中3個(gè)時(shí)期較紅肉材料均存在高表達(dá)現(xiàn)象，推測(cè)其參與了果實(shí)顏色的形成。FAD還原酶涉及到植物體內(nèi)多種氧化還原反應(yīng)，而研究證明FAD作為CRISTO、LCYB、LCYE、ZEP等多種酶的輔助因子，在色素的積累過(guò)程中發(fā)揮作用，低含量的FAD更有利于果實(shí)的著色[33-34]。本研究中，在4個(gè)白肉材料中表達(dá)量較高，而在紅肉材料中表達(dá)量較低，推測(cè)其通過(guò)影響類胡蘿卜素的積累進(jìn)而影響果肉顏色。

4 結(jié)論

通過(guò)GWAS關(guān)聯(lián)分析以及Fst方式鑒定到6個(gè)與果肉顏色顯著關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)，通過(guò)基因表達(dá)量分析篩選到5個(gè)與呈色有關(guān)的基因，分別是（促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶MAPKKK17）、（膽色素原脫氨酶PBGD）、（轉(zhuǎn)錄因子TCP7）、（超氧化物歧化酶SOD3）、（FAD合成酶2），初步推測(cè)這些基因參與了柚果肉顏色的形成。

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Genetic Variation Analysis and Candidate Genes Mining of Regulating Flesh Color in Pomelo

CHENG Li, YANG ShengNan, ZHU YanSong, WANG Xu, ZHAO WanTong, LI RenJing, LI Pei, YUAN ZhongJie, JIANG Dong

Citrus Research Institute of Southwest University, Chongqing 400712

【Objective】The flesh color is an important appearance and quality trait of pomelo varieties. The aim of this study was to excavate variation loci and genes significantly related to the flesh color of pomelo varieties, so as to lay a foundation for further understanding the flesh color development mechanism and marker-assisted breeding of pomelo varieties. 【Method】100 pomelo accessions were used to identify their flesh color with a color difference meter, and classified based on their phenotype results. The simplified genome sequencing of 100 pomelo accessions was carried out using GBS (genotyping-by-sequencing) technology. The eigenvalues and eigenvectors of the genotype data obtained from sequencing were calculated by GCTA software to analyze the population structure, and the genetic differentiation index (Fst) of two different flesh color populations were calculated using Plink 2.0 software. The GLM model in GEMMA software was adopted to perform genome-wide association analysis, and the variation loci significantly associated with color phenotype were identified for further allelic variation analysis. According to the citrus linkage disequilibrium (LD) distance, the candidate genes located in the 25 kb adjacent region around the variation loci that might be related to the forming of flesh color were screened out, four white and four red pomelo accessions were randomly selected to perform qPCR to obtain the candidate genes expression at different fruit development stages. 【Result】According to the phenotype of flesh color, 100 accessions were divided into two categories corresponding to white and red pomelo accessions, including 58 white flesh pomelos and 42 red flesh pomelos. Six SNP sites with Fstindex greater than 0.4 and -log10(P)＞9 were screened out after Fst genetic differentiation analysis and GWAS genome-wide association analysis. The genotypes of six variation SNPs sites were extracted from 100 pomelos accessions and the genotypes of these SNPs could be used to predict the flesh color of pomelos. A total of 14 genes that function annotated as isoprene synthesis, plastid development, abscisic acid signal regulation, ethylene response related genes and transcription factors were screened and selected. Genes expression analysis showed that(mitogen-activated protein kinase kinase MAPKKK17),(chloroplast porphyrinogen deaminase),(transcription factor TCP7),(chloroplast superoxide dismutase SOD3),(FAD synthetase 2) were related to the forming of flesh color in pomelos. 【Conclusion】 A total of 6 SNP sites significantly associated with flesh color in pomelos accessions were identified by GWAS and Fst analysis. A total of 14 genes within the 25 kb regions around the mutation SNPs site were screened and annotated. The gene expression analysis showed that five genes might be involved in the forming of flesh color in pomelo accessions.

pomelo; flesh color; Fst; GWAS; candidate genes

2023-02-13；

2023-05-17

國(guó)家科技重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（2019YFD1001400）、柑橘種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定項(xiàng)目（19211142）、西南大學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)研究項(xiàng)目（SYJ2023021）

程莉，E-mail：chengliak@163.com。通信作者江東，E-mail：jiangdong@cric.cn

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.17.015

（責(zé)任編輯 趙伶俐）