生物技術(shù)專業(yè)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的建立與思考
——以反向點(diǎn)雜交檢測(cè)β-地中海貧血基因類型為例

唐 敏 王咸壽 鄭 琳 杜冠魁 顏冬菁

海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院 海南海口 571199

作為地方院校,本校生物技術(shù)專業(yè)定位于應(yīng)用型人才的培養(yǎng),分子生物學(xué)及診斷技術(shù)是其專業(yè)課程之一。由于本校地處在熱帶地區(qū)的海南省,β-地中海貧血(β-thalassemia)是本地常見遺傳疾病。研究發(fā)現(xiàn)海南省育齡人群中β-地中海貧血突變基因攜帶率與患病率達(dá)12.95%,常見的突變類型有CD41-42(-TTCT)、-28(A>G)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、CD71-72(+A)以及CD17(A>T),以CD41-42(-TTCT)最常見[1]。臨床上采用反向點(diǎn)雜交檢測(cè)常見的β-地中海貧血基因類型,本校在生物技術(shù)專業(yè)開設(shè)反向點(diǎn)雜交檢測(cè)β-地中海貧血基因類型的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,作為分子生物學(xué)診斷技術(shù)的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容之一。筆者采取分子克隆的方法,將常見的β-珠蛋白基因突變類型克隆至質(zhì)粒上,建立模板庫,豐富實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。同時(shí)對(duì)本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的教學(xué)提出思路,采用小教師+翻轉(zhuǎn)課堂教學(xué)法,充分激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣,且思政教育同行,以期對(duì)以學(xué)生為中心的教學(xué)改革起拋磚引玉的作用。

1 β-珠蛋白基因類型模板庫的建立

攜帶β-珠蛋白基因CD41-42(-TTCT)、-28(A>G)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、CD71-72(+A)與CD17(A>T)雜合子突變的基因組DNA由本實(shí)驗(yàn)室保存[2]。分別以這5種雜合子突變的基因組DNA為模板,設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增β-珠蛋白基因,上游引物序列為CATATTCTGGAGACGCAGGAAGAGA,下游引物序列為CATGGAAGGAACACTTCAGGGGAAA,PCR產(chǎn)物為2432bp。采用LA Taq(寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,體系如下:基因組模板1μL,上下游引物各0.2μM,dNTPs 200μM,LA taq 2.5U,1×buffer,補(bǔ)水至25μL;擴(kuò)增程序如下:95℃ 10min,開啟32個(gè)循環(huán)(95℃ 50s,61℃ 30s,72℃ 2.5min),72℃ 5min。回收PCR目的片段,與pGEM-T easy載體(Promega)進(jìn)行TA克隆,挑白斑進(jìn)行菌落PCR鑒定。由于基因組DNA模板都是雜合子,菌落PCR鑒定正確的重組子可能是β-珠蛋白突變類型,也可能是野生型,最終由測(cè)序確定其基因型。測(cè)序結(jié)果表明,在32個(gè)循環(huán)數(shù)的前提下,LA Taq擴(kuò)增2432bp的片段,有3～5個(gè)隨機(jī)突變。挑取目標(biāo)突變類型附近無突變的重組質(zhì)粒作為模板,采用β-地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒[亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司]檢測(cè)β-珠蛋白基因突變類型,結(jié)果如圖1所示,實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論值相符。其中單一的重組質(zhì)粒結(jié)果如果圖1A～圖1F所示,檢測(cè)結(jié)果為純合子突變,結(jié)果分別判讀為IVS-Ⅱ-654(C>T)純合子、-28(A>G)純合子、CD41-42(-TTCT)、野生型、CD71-72(+A)純合子與CD17(A>T)純合子;將兩種不同突變類型的質(zhì)粒混合,得到復(fù)合突變類型,如圖1G所示,結(jié)果判讀為IVS-Ⅱ-654(C>T)與-28(A>G)復(fù)合突變;將突變型質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒混合作為模板,檢測(cè)結(jié)果為雜合子突變,如圖1F與圖1G所示,結(jié)果分別判讀為CD41-42(-TTCT)雜合子與-28(A>G)雜合子。結(jié)果表明成功建立該教學(xué)實(shí)驗(yàn)。

圖1 以重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行反向點(diǎn)雜交檢測(cè)β-珠蛋白基因型

A-I的結(jié)果判讀如下:A.IVS-Ⅱ-654(C>T)純合子;B.-28(A>G)純合子;C.CD41-42(-TTCT)純合子;D.野生型;E.CD71-72(+A)純合子;F.CD17(A>T)純合子;G.IVS-Ⅱ-654(C>T)與-28(A>G)復(fù)合突變;H.CD41-42(-TTCT)雜合子;I.-28(A>G)雜合子;J為膜條上各斑點(diǎn)的基因型,N表示對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的正常基因型,M表示對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的突變基因型。

2 以學(xué)生為中心的教學(xué)思考

本實(shí)驗(yàn)面向第6學(xué)期(大三下學(xué)期)的生物技術(shù)專業(yè)本科生開設(shè),該年級(jí)的學(xué)生已掌握生物化學(xué)的理論知識(shí)與實(shí)驗(yàn)技術(shù),掌握分子生物學(xué)的基本操作,如提取基因組DNA、提取全血或者組織RNA、瓊脂糖凝膠電泳、PCR技術(shù)等。因此對(duì)本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目提出如下教學(xué)目標(biāo):(1)知識(shí)目標(biāo):理解反向點(diǎn)雜交檢測(cè)β-地中海貧血基因突變的原理,熟悉PCR與核酸雜交的原理與實(shí)驗(yàn)操作,理解β-地中海貧血致病機(jī)制;(2)能力目標(biāo):提高分析問題、提出問題以及解決問題的能力;(3)情感目標(biāo):培養(yǎng)良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣,培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)倪壿嬎季S,鼓勵(lì)科普宣教。針對(duì)以上教學(xué)目標(biāo),堅(jiān)持以學(xué)生為中心的教學(xué)方式,摒棄教師滿堂灌的方式,筆者提出以下教學(xué)思路。

2.1 招募小教師,師生互換角色

小教師模式的教學(xué)方法已有報(bào)道[3-4],即開課前招募熱愛生物學(xué)科、愿意參與實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備和輔助教學(xué)的學(xué)生,在課前參與實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備、預(yù)實(shí)驗(yàn)操作,課中參與實(shí)驗(yàn)原理的分享、實(shí)驗(yàn)安全管理、主持分組討論等。筆者曾在本校2020級(jí)生物技術(shù)學(xué)生中發(fā)布問卷,結(jié)果表明有73%(73/100)的學(xué)生愿意來當(dāng)小教師,說明相對(duì)于傳統(tǒng)的教學(xué)方式,學(xué)生更樂意采取主動(dòng)學(xué)習(xí)的形式。通過小教師模式的教學(xué),促進(jìn)師生之間的交流互動(dòng),增加學(xué)生在實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段的動(dòng)手機(jī)會(huì),促進(jìn)學(xué)生對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)備、授課過程的思考,可幫助提高其提出問題、分析問題以及解決問題的能力;同時(shí),小教師在授課過程可選擇性地講解一部分內(nèi)容,在實(shí)驗(yàn)過程充當(dāng)小助手,而教師對(duì)小教師的講解與操作示范進(jìn)行補(bǔ)充,師生合作,促進(jìn)雙方在教學(xué)過程中更快進(jìn)入狀態(tài),達(dá)到雙贏的效果。

2.2 充分利用課堂等待時(shí)間,翻轉(zhuǎn)課堂

在本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目教學(xué)過程中,有很多需要等待的時(shí)間,例如PCR需要約3小時(shí),雜交需要約1小時(shí)等。為在規(guī)定課時(shí)內(nèi)完成實(shí)驗(yàn)教學(xué),可先加樣PCR后,在PCR等待的時(shí)間,可以由小教師講解實(shí)驗(yàn)原理,組織實(shí)驗(yàn)小組同學(xué)分組進(jìn)行討論,討論主題包括但不限于如下:(1)地中海貧血的定義、發(fā)病率、危害以及診斷;(2)“反向點(diǎn)雜交”的解讀,為什么叫“反向”“點(diǎn)”“雜交”?實(shí)驗(yàn)操作說明書的解讀,實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判讀;(3)實(shí)驗(yàn)過程中PCR操作如何避免假陽性?(4)人血紅蛋白的基因表達(dá)譜,分析β珠蛋白基因結(jié)構(gòu),分析各常見突變基因型如CD41-42(-TTCT)、-28(A>G)、IVS-Ⅱ-654(C>T)、CD71-72(+A)與CD17(A>T)的發(fā)生頻率以及致病機(jī)制;(5)如果反向點(diǎn)雜交結(jié)果陰性,是否代表該模板DNA絕對(duì)是野生型,沒有突變位點(diǎn)?(6)如果將來有一天大家就職于某教學(xué)實(shí)驗(yàn)室,需要建立反向點(diǎn)雜交檢測(cè)β-珠蛋白基因突變類型的教學(xué)實(shí)驗(yàn),如何建立模板?小教師可以將本實(shí)驗(yàn)如何操作的過程分享給大家。(7)檢測(cè)β-珠蛋白的突變類型,除了臨床上常用的反向點(diǎn)雜交方法,還有其他的方法嗎?

翻轉(zhuǎn)課堂需要同學(xué)們?cè)谡n前做好預(yù)習(xí)的功課,目前筆者所在的生物技術(shù)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開展實(shí)驗(yàn)操作視頻的拍攝,在教學(xué)過程中可通過學(xué)習(xí)通平臺(tái)發(fā)布教學(xué)視頻與教學(xué)資料以及在平臺(tái)上布置實(shí)驗(yàn)報(bào)告等,有利于教學(xué)實(shí)施。

2.3 因材施教,延伸課堂內(nèi)容

有文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]以地中海貧血為例,在臨床醫(yī)學(xué)實(shí)踐教學(xué)中采用PBL教學(xué)方法,課堂討論的主題更注重于疾病的病因、診斷、治療以及遺傳咨詢等。與培養(yǎng)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)學(xué)生不同,本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的開設(shè)對(duì)象是生物技術(shù)專業(yè)的學(xué)生,應(yīng)該更注重于應(yīng)用能力的培養(yǎng),例如實(shí)驗(yàn)的正確操作、實(shí)驗(yàn)原理的理解,并能根據(jù)實(shí)際的實(shí)驗(yàn)室條件解決具體的問題。因此,除了在翻轉(zhuǎn)課堂中討論的主題之外,還可以適當(dāng)延伸課堂內(nèi)容,作為自主學(xué)習(xí)的內(nèi)容。例如,地中海貧血與瘧疾的關(guān)系[7];反向點(diǎn)雜交檢測(cè)β-地中海貧血基因經(jīng)典文獻(xiàn)的閱讀[8];一步法檢測(cè)β-地中海貧血基因突變——熒光探針PCR法[9],通過閱讀該文獻(xiàn),對(duì)比兩種方法的優(yōu)缺點(diǎn),引導(dǎo)同學(xué)們思考分子診斷試劑的技術(shù)研發(fā),激發(fā)同學(xué)們開發(fā)先進(jìn)分子診斷試劑的興趣,提升生物技術(shù)專業(yè)的自豪感。

2.4 思政教育與教學(xué)同行

立德樹人是高等教育的根本任務(wù),而思政教育是落實(shí)立德樹人的途徑之一。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過程中:(1)應(yīng)加強(qiáng)誠信教育,尊重原始數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)結(jié)果;(2)培養(yǎng)良好的實(shí)驗(yàn)習(xí)慣,例如當(dāng)天的實(shí)驗(yàn)記錄盡量當(dāng)天整理好,以免時(shí)間長(zhǎng)了遺忘;不戴手套隨意關(guān)門,嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)區(qū)域劃片等;(3)注意實(shí)驗(yàn)室安全,不在實(shí)驗(yàn)室吃飯,及時(shí)無害化處理實(shí)驗(yàn)材料,例如抽取質(zhì)粒的菌液應(yīng)高壓滅菌處理;(4)鼓勵(lì)科普宣教,海南省是地中海貧血高發(fā)區(qū),特別是β-地中海貧血,發(fā)生純合子突變時(shí),患兒在出生6個(gè)月后才開始表現(xiàn)出癥狀,為家庭與社會(huì)帶來很大的負(fù)擔(dān),因此大學(xué)生可在假期做好科普工作,鼓勵(lì)高發(fā)區(qū)育齡夫婦做好產(chǎn)前診斷工作;(5)在教學(xué)中培養(yǎng)團(tuán)隊(duì)合作精神,培養(yǎng)獲取知識(shí)的能力等。

結(jié)語

小教師教學(xué)模式有助于提高學(xué)生動(dòng)手能力,促進(jìn)其思考,內(nèi)化知識(shí)點(diǎn);而翻轉(zhuǎn)課堂是以學(xué)生為中心,促進(jìn)其提出問題、分析問題以及解決問題的能力。通過建立β-地中海貧血常見突變基因類型模板庫,豐富實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,并結(jié)合小教師與翻轉(zhuǎn)課堂模式設(shè)計(jì)課堂,有助于推動(dòng)以學(xué)生為中心的實(shí)驗(yàn)教改實(shí)踐,為提高教學(xué)質(zhì)量提供參考與借鑒。