姜黃素介導過氧化氫對肺癌細胞A549氧化應激及PI3K/PKC通路的影響

王志強 周斌鋒 彭兵鋒 毛宇昂

(鷹潭市人民醫(yī)院胸外科,江西 鷹潭 335000)

肺癌細胞主要起源于支氣管的黏膜上皮細胞病變。肺癌患者早期無特異性特征,主要原因是肺泡無感覺神經(jīng),無法感知到疼痛,隨著病情的發(fā)展,患者會產(chǎn)生咳嗽、咳血、胸痛等癥狀。誘導肺癌產(chǎn)生的常見因素有吸煙、工作或生活環(huán)境中接觸石棉、砷等有害物質、家族史等。過氧化氫(H2O2)是氧化還原代謝過程中的產(chǎn)物,在正常的生理狀態(tài)下,H2O2水平是細胞通過活性氧(ROS)生成及清除的平衡系統(tǒng)進行調控,當發(fā)生病理變化時,H2O2水平脫離細胞控制,H2O2水平發(fā)生紊亂,胞內核酸、蛋白質結構及功能單位受損,甚至導致細胞凋亡,引發(fā)癌癥及嚴重并發(fā)癥,故人體細胞正常的生理代謝離不開平衡的H2O2水平〔1〕。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶C(PKC)具有調控細胞增殖及凋亡的作用。PKC多分布于哺乳動物的器官、組織和細胞中,是細胞質內的脂質依賴性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,依賴磷脂散發(fā)活性,可以被Ca2+激活,在細胞內進行信號傳導,維持細胞的生長代謝、細胞分裂、增殖及凋亡,重塑細胞骨架蛋白,具有調節(jié)離子通道及細胞分泌的作用〔2〕。由于肺癌患者早期無特異性癥狀,導致其發(fā)現(xiàn)時多為中晚期,常見的治療方法為放、化療法,其中選擇放療的患者居半數(shù)以上,但因放療進程較長,患者治療依從性大大降低,影響預后。近年來發(fā)現(xiàn)〔3〕,中醫(yī)對于肺癌的治療具有一定的作用,且無副作用。姜黃素具有抗炎、抗氧化等作用,已有學者證實,姜黃素在乳腺癌〔4〕、胃癌〔5〕、肺癌〔6〕等中具有抗癌作用,但其對于肺癌治療的具體機制尚未完全掌握。本研究探討姜黃素對肺癌細胞外源性H2O2氧化應激及PI3K/PKC通路的作用機制。

1 材料和方法

1.1細胞來源 肺癌細胞A549來自上海和序生物科技有限公司。

1.2實驗試劑、儀器與藥物 姜黃素(深圳樂芙生物公司,純度99%);H2O2試劑盒(武漢伊萊瑞特生物公司);噻唑藍(MTT)溶液(上海尚寶生物公司);流式細胞儀(北京煥彩元合科技公司,型號:BD FACSCelesta);超氧化物岐酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(合肥萊爾生物公司);PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC一抗(深圳子科生物公司);辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗(西安沐森生物公司)。

1.3姜黃素配制 姜黃素用二甲基亞砜(DMSO)溶解配成220 μmol/L母液,-20 ℃保存,實驗前用RPMI1640 培養(yǎng)基分別稀釋配成所需濃度〔7〕。

1.4細胞培養(yǎng)與分組 培養(yǎng):將A549細胞接種于6孔板中培養(yǎng),RPMI1640培養(yǎng)液中含鏈霉素及10%胎牛血清,常規(guī)培養(yǎng),待細胞融合至80%時,傳代,2～3代備用。肺癌組:肺癌細胞常規(guī)培養(yǎng),不加入姜黃素;姜黃素低組:在含有肺癌細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中加入40 μmol/L姜黃素;姜黃素中組:在含有肺癌細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中加入80 μmol/L姜黃素;姜黃素高組:在含有肺癌細胞培養(yǎng)液的培養(yǎng)基中加入160 μmol/L姜黃素。

1.5檢測指標

1.5.1MTT檢測細胞增殖 取各組肺癌細胞,在96孔板中進行接種,每組復孔數(shù)量選擇5個,向每孔(細胞數(shù)8×103個)加入100 μl完全培養(yǎng)基,進行3次重復試驗。于24、48、72 h分別加入20 μl(5 g/L)MTT,靜止6 h后,向每孔加入150 μl十二烷基硫酸鈉(SDS,10%,mol/L),37 ℃培養(yǎng)箱中避光過夜孵育,取出96孔板,用多功能酶標儀檢測波長在570 nm處吸光度(OD)值。

1.5.2采用流式細胞儀檢測細胞凋亡 于96孔板中接種各組肺癌細胞常規(guī)培養(yǎng),24 h后棄培養(yǎng)液,含乙二胺四乙酸的胰酶消化細胞,離心5 min,2 000 r/min,棄去上清液,PBS清洗。計入500 μl結合緩沖液,10 μl碘化丙啶(PI)及5 μl膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(AnnexinⅤ-FITC),混勻,無光孵育5 min,流式細胞儀測細胞凋亡。

1.5.3H2O2跨膜轉運的檢測 取各組肺癌細胞,在6 cm培養(yǎng)皿中進行接種操作,數(shù)量控制在1×105個/ml。將慢病毒包裝質粒和目的質粒通過脂質體轉染法轉染到肺癌細胞中。確保細胞無污染,轉染48 h后,收集培養(yǎng)上清液進行離心及過濾,較高滴度前提下進行轉染。病毒于-80 ℃冰箱中冷凍保存。取對數(shù)生長期的肺癌細胞,胰酶消化,在6孔板以5×105個/ml進行接種,2 ml/孔,置于37 ℃且體積分數(shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)細胞,細胞生長至70.0%～80.0%傳代,100 μmol/L的H2O2完全培養(yǎng)基作用6 h,消毒舍棄舊培養(yǎng)基,更換37 ℃ 10 μmol/L的2,7-雙氯熒光素蛋白乙酸鹽(DCFH-DA)孵育30 min,以上流程完成后,進行細胞的消化和收集,通過激光共聚焦檢測細胞內代表ROS(主要為H2O2)水平的綠色熒光強度。

1.5.4熒光法分析肺癌細胞ROS水平 對達到對數(shù)生長期的A549細胞進行胰酶消化處理,在6孔板中接種,細胞生長實現(xiàn)80%的孔面積后,消毒舍棄舊培養(yǎng)基,加入無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),12 h后更換培養(yǎng)液,每組均設3個復孔。每組取1×105個細胞,加入DCFH-DA 1 ml,濃度設置10 μmol/L,與細胞混勻后,避光靜置20 min,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次去除細胞外DCFH-DA溶液,通過熒光強度分析ROS水平。

1.5.5比色法記錄氧化應激相關指標SOD、MDA含量 培養(yǎng)細胞生長至培養(yǎng)皿約80%時進行消化,培養(yǎng)皿密度選擇4×105/ml,在60 mm×15 mm培養(yǎng)皿中進行接種,細胞生長至16 h貼壁后更換加入不同劑量藥物的完全培養(yǎng)液,24 h后收集培養(yǎng)上清液,參照試劑盒說明書加入試劑,與細胞混勻后,避光靜置10 min,將雙蒸水調零,光徑設置1 cm,在532 nm及550 nm處分別測SOD、MDA各組上清OD值,記錄氧化應激相關指標SOD及MDA含量。

1.5.6Western印跡檢測PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC表達 取各組細胞進行胰酶消化,離心機12 000 r/min離心5 min取上清液,按照4∶1的比例加入裂解液稀釋蛋白樣品后,沸水浴中煮沸5 min,用二喹啉甲酸(BCA)法測總蛋白濃度,每個孔的蛋白水平為20 μg,十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。冰箱設置4 ℃對轉印緩沖液預冷,然后全部轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入脫脂奶粉,全程封閉時長為1 h。加入PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC一抗(稀釋比例1∶500)進行3次TTBS漂洗,每次10 min,過夜溫度設置4 ℃。然后加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1∶2 000)進行3次TTBS漂洗,每次10 min,37 ℃孵育45 min,取二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒分別在1 ml水中加A、B、C液各1滴,酶催化底物發(fā)光液(ECL)涂布于膜上條帶相應位置,于LAS4000Mini型化學發(fā)光成像分析儀中曝光;用JY-Clear圖像分析軟件分析目標條帶的蛋白光密度值。

1.6統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組肺癌細胞增殖情況檢測結果 肺癌組肺癌細胞OD值明顯高于姜黃素低、中、高組(P<0.05),姜黃素低組肺癌細胞OD值明顯高于姜黃素中、高組(P<0.05),姜黃素中組肺癌細胞OD值明顯高于姜黃素高組(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺癌細胞A549增殖對比值,n=6)

2.2各組肺癌細胞凋亡檢測結果 肺癌組細胞凋亡率〔(3.45±0.02)%〕明顯低于姜黃素低組、姜黃素中組及姜黃素高組〔(9.08±0.43)%、(12.54±0.21)%及(22.36±2.48)%;F=237.2000,P<0.001〕,姜黃素低組細胞凋亡率明顯低于姜黃素中組(t=17.710,P<0.01),與姜黃素中組相比,姜黃素高組肺癌細胞凋亡率明顯升高(t=9.665,P<0.001),見圖1。

圖1 各組肺癌細胞凋亡

2.3各組肺癌細胞中 H2O2的跨膜轉運水平 與肺癌組相比、姜黃素各劑量組肺癌細胞內代表 ROS(主要為 H2O2)水平的綠色熒光增強,且以姜黃素高組熒光最強,可知姜黃素可促進 H2O2的跨膜轉運。見圖2。

圖2 各組肺癌細胞H2O2跨膜轉運水平(免疫熒光染色,×200)

2.4各組肺癌細胞中氧化應激水平檢測結果 與肺癌組相比,姜黃素低、中、高組SOD、ROS水平明顯升高,MDA水平明顯降低(P<0.05),與姜黃素低組相比,姜黃素中、高組肺癌細胞中SOD、ROS水平明顯升高,MDA水平明顯降低(P<0.05),與姜黃素中組相比,姜黃素高組肺癌細胞SOD、ROS水平明顯升高,MDA明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組肺癌細胞中SOD、MDA、ROS水平、PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC蛋白水平比較

2.5各組肺癌細胞中PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC蛋白水平 肺癌組肺癌細胞中PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC蛋白水平明顯高于姜黃素低、中、高組(P<0.05),姜黃素低組肺癌細胞中PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC蛋白水平明顯高于姜黃素中、高組(P<0.05)。姜黃素中組肺癌細胞中PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC蛋白水平明顯高于姜黃素高組(P<0.05)。見表2、圖3。

圖3 各組肺癌細胞中PI3K、p-PI3K、PKC、p-PKC蛋白表達

3 討 論

全球范圍內,肺癌的發(fā)病率及死亡率均呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。肺癌在世界上的發(fā)病率在所有癌癥中排名第三,死亡率排名第二,至今對人類的生命安全仍有較大的威脅〔8〕。

相關研究結果顯示〔9〕,姜黃素對腫瘤細胞增殖的作用明顯,在體內外均可進行抑制。有文獻報道〔10〕,姜黃素可特異性地減少編碼融合蛋白表達,對激活的Ra8信號途徑進行阻斷下調,從而實現(xiàn)抑制K562細胞增殖的目的。有實驗結果表明〔11〕,姜黃素不但可以下調B細胞淋巴瘤(Bcl-2)患者腹水細胞CA46的c-myc,還能抑制Bcl-2、突變型p53蛋白和mRNA的過度表達,通過提高Fas蛋白和mRNA的水平減少癌細胞增殖。在本文中,在經(jīng)過姜黃素干預后,同時肺癌細胞增殖能力降低、凋亡能力增加,且均呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。楊秦梅等〔12〕研究提出,姜黃素可通過調控Notch信號通路促進肺癌細胞凋亡并抑制其增殖。本研究說明,姜黃素可以抑制肺癌細胞增值,促進其凋亡。

H2O2由ROS產(chǎn)生,研究發(fā)現(xiàn)〔13〕,臨床常用的紫杉醇和順鉑等抗腫瘤藥物會升高腫瘤細胞中ROS的水平,造成原有氧化還原系統(tǒng)紊亂,破壞代謝通路,提高誘導細胞凋亡的風險。H2O2作為一種信號分子在多種生物進程中也發(fā)揮著重要作用。研究者發(fā)現(xiàn)〔14〕,H2O2對癌細胞的影響是抑制作用還是促進作用取決于H2O2的濃度。低濃度的H2O2會加速腫瘤細胞生長,而適當偏高濃度的H2O2可以通過調節(jié)細胞內某些信號通路實現(xiàn)抑制癌細胞增殖的作用。研究表明〔15〕,H2O2對腫瘤抑制基因的表達,包括細胞周期進程、細胞凋亡、腫瘤血管形成、癌細胞的遷移和侵襲等過程都具有調節(jié)作用。乳腺癌細胞的相關研究顯示〔16〕,50～200 μmol/L H2O2能夠抑制癌細胞的增殖,而在肝癌細胞的研究中〔17〕,1～10 μmol/L H2O2會促進癌細胞的增殖。研究證實〔18〕,存在于細胞內復雜的氧化還原平衡,影響細胞的正常代謝、增殖、分化及凋亡。氧化應激水平會調控腫瘤細胞凋亡周期和增殖,ROS低含量時,腫瘤細胞快速增殖、代謝和轉移,信號通路分子呈現(xiàn)表達,促進腫瘤癌變;ROS高含量時,通過抑制腫瘤細胞的生長,提高癌細胞凋亡率。在生物進化的過程中,細胞酶系統(tǒng),包括SOD等,可直接解除ROS對細胞的攻擊。細胞內出現(xiàn)的主要氧化損傷屬于細胞膜脂質過氧化,而MDA作為細胞膜脂質過氧化的終產(chǎn)物之一,在氧化損傷出現(xiàn)時,增加MDA生成量,增量后的MDA又會引發(fā)細胞多方面的連鎖損傷。姜黃素是從中藥姜黃、郁金、莪術等職務中的根莖中提取的一種天然黃色酚類色素,其抗腫瘤效應近年來備受關注。有研究證實〔19〕,姜黃素有確切的抗腫瘤、抗氧化、抗轉移、抗血管生成等作用。于洪丹等〔20〕通過體外細胞實驗研究表明,姜黃素可通過調控YAP信號通路促進氧化應激反應,進而抑制肝癌細胞活性,誘導其凋亡。本研究結果提示,姜黃素可通過提高H2O2轉運,促進調控氧化應激反應,從而影響肺癌細胞生物學行為。

PI3K作為特異性催化磷脂醇(PI)3位羥基磷酸化,可分泌肌醇酯質產(chǎn)物激酶。細胞的增殖、分化、凋亡及遷移可通過PI3K信號通路進行調節(jié)。近年來有研究結果表明〔21〕,在腫瘤細胞的發(fā)育、活化、增殖及分化過程中,都有PI3K的參與。激活后的PI3K通過轉移到細胞膜,催生3,4,5-磷酸磷脂酰肌醇(PIR)。而PKC也可以被PI3K激活,從而對細胞分泌、肌肉收縮、細胞擴增和分化等很多體內的生理過程進行干預。PKC可以激活PI3K信號通路,PKC可以與鈣調蛋白結合,控制細胞膜的結合。已有研究結果證實〔22〕,腫瘤轉移能力與膜PKC活性息息相關,高轉移細胞的膜PKC活性明顯高于低轉移細胞的膜PKC活性。另有研究發(fā)現(xiàn)〔23〕姜黃素可通過PI3K/蛋白激酶B(AKT)信號通路調節(jié)多種腫瘤細胞的生物學行為。在本研究中發(fā)現(xiàn),在經(jīng)過姜黃素的干預后,PI3K、PKC水平有所降低,且具有一定的藥物劑量依賴性。婁芮等〔24〕在對肺癌的研究中提出,通過抑制PI3K/AKT/PKC通路水平,促進肺癌細胞的凋亡,并抑制其增殖。李優(yōu)等〔25〕在對肺癌的研究中提出,姜黃素通過調控PI3K/AKT通路水平,抑制肺癌細胞上皮間質轉化,降低癌細胞的遷移能力。薛曉偉等〔26〕在研究中提出,抑制H2O2水平可通過調控PI3K/AKT通路,促進腺髓質嗜鉻細胞瘤細胞凋亡。

本研究與上述研究結果相似。姜黃素可能是由于抑制H2O2水平進而調控PI3K/PKC通路,抑制肺癌細胞增殖。