SNHG14調(diào)控miR-181b對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響

張曉鳳 代杰 祁文祎

(滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 滄州 061001)

缺血性腦損傷(腦卒中)是常見的腦血管疾病,具有較高的致殘率和致死率〔1〕。血管內(nèi)皮細(xì)胞是血液和組織進(jìn)行物質(zhì)交換的屏障,可分泌和釋放多種活性物質(zhì),參與多種生理和病理過程。活性氧的過量產(chǎn)生可直接損傷腦血管內(nèi)皮細(xì)胞,進(jìn)而加重腦組織損傷〔2〕。因此,探究影響活性氧誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的分子機(jī)制可能為缺血性腦損傷的治療提供新思路。小核仁RNA宿主基因(SNHG)14是一種長鏈非編碼RNA(lncRNA),參與腫瘤〔3〕、骨質(zhì)疏松〔4〕、動(dòng)脈粥樣硬化〔5〕等多種疾病的發(fā)展進(jìn)程,是疾病治療的潛在分子靶點(diǎn)。研究顯示,SNHG14可靶向調(diào)控miR-182-5p/Bcl-2/腺病毒E1B相互作用蛋白(BINP)3軸促進(jìn)氧糖剝奪誘導(dǎo)的小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22自噬,進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,SNHG14可能是腦缺血再灌注損傷的治療靶標(biāo)〔6〕。生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示,SNHG14可能靶向結(jié)合miR-181b。miR-181b在缺血性腦卒中患者中呈低表達(dá),其低表達(dá)可能增加缺血性腦卒中的患病風(fēng)險(xiǎn)〔7〕。但目前SNHG14是否通過調(diào)控miR-181b影響活性氧誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷尚不清楚。本研究采用H2O2誘導(dǎo)人腦血管內(nèi)皮細(xì)胞BB19損傷模型,探討SNHG14通過調(diào)控miR-181b對(duì)H2O2誘導(dǎo)BB19細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞和試劑 BB19細(xì)胞系,上海晶抗生物工程有限公司;DMEM培養(yǎng)基、二喹啉甲酸(BCA)檢測(cè)試劑盒、雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒和膜聯(lián)蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)試劑盒,北京索萊寶; 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑盒,大連寶生物;胎牛血清,LipofectamineTM2000試劑盒,美國Invitrogen;野生型(WT)和突變型(MUT)SNHG14熒光素酶報(bào)告載體、SNHG14小干擾RNA(si-SNHG14)及小干擾RNA陰性對(duì)照序列(si-NC)、miR-181b 模擬物(mimics)和抑制劑(inhibitor)、模擬對(duì)照序列(miR-NC)及抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、引物序列,上海生工;過氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒,南京建成;Western印跡實(shí)驗(yàn)所需抗體,美國Santa Cruz公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 BB19細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。BB19細(xì)胞接種至6孔板培養(yǎng)24 h。LipofectamineTM2000試劑分別與si-NC、si-SNHG14、miR-NC、miR-181b mimic、si-SNHG14和anti-miR-NC、si-SNHG14和miR-181b inhibitor混合均勻,緩慢加至6孔板中(100 μl/孔),孵育細(xì)胞24 h。

1.3細(xì)胞分組處理 BB19細(xì)胞分為對(duì)照(Con)組(用常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng))和模型(Model)組(用含100 μmol/L〔8〕H2O2的培養(yǎng)基培養(yǎng))。轉(zhuǎn)染si-NC、si-SNHG14、miR-NC、miR-181b mimic、共轉(zhuǎn)染si-SNHG14與anti-miR-NC、si-SNHG14與miR-181b inhibitor的細(xì)胞均用含100 μmol/L H2O2的培養(yǎng)基培養(yǎng),并分別記為分為Model+si-NC組、Model+si-SNHG14組、Model+miR-NC、Model+miR-181b mimic、Model+si-SNHG14+anti-miR-NC組和Model+si-SNHG14+miR-181b inhibitor組。

1.4RT-qPCR檢測(cè)SNHG14和miR-181b mRNA表達(dá) 按1.3分組處理48 h后,Trizol試劑提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。2-△△Ct法計(jì)算SNHG14相對(duì)GAPDH、miR-181b相對(duì)U6的表達(dá)。引物序列:SNHG14上游5'-GGGTGTTTACGTAGACCAGAACC-3′,下游5′-CTTCCAAAAGCCTTC-TGCCTTAG-3′;GAPDH上游5′-GAAGGTGAAGGTC-GGAGTC-3′,下游5′-GAAGATGGTGATGGG-ATTTC-3′;miR-181b上游5′-GTCGAGATAGCTAGGCCGC-3′,下游5′-TAGAGAGCGCGTGAGC-3′;U6上游5′-GCCCCCGCCTCCGCCGCCGCC-3′,下游5′-ATATGGAACGCTTCACGAATT-3′。

1.5CCK-8法 各組BB19細(xì)胞接種于96孔板,接種個(gè)數(shù)均為1.0×104個(gè)/孔。培養(yǎng)4 h后,加CCK-8(10 μl/孔)處理24、48和72 h。將細(xì)胞孵育1.5 h后,設(shè)置酶標(biāo)儀檢測(cè)波長為450 nm,測(cè)定各組光密度(OD)值。

1.6流式細(xì)胞分析 收集各組BB19細(xì)胞,利用Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.7Western印跡 各組細(xì)胞中總蛋白用RIPA試劑提取,然后用二喹啉甲酸(BCA)法定量。蛋白用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜。膜用5 %脫脂奶粉封閉,然后與anti-Bcl-2(1∶500)、anti-Bax(1∶500)和anti-GAPDH(1∶1 000)孵育過夜,最后用山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育1 h。用電化學(xué)發(fā)光(ECL)溶液顯示蛋白條帶。

1.8氧化應(yīng)激檢測(cè) 裂解各組細(xì)胞,離心取上清液,分別利用MDA、SOD和CAT試劑盒檢測(cè)上清中其表達(dá)。

1.9雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 接種BB19細(xì)胞至6孔板中,培養(yǎng)24 h后,將LipofectamineTM2000試劑分別與WT-SNHG14和miR-NC(或miR-181b mimics)、MUT-SNHG14和miR-NC(或miR-181b mimics)混合均勻,緩慢加至6孔板中(100 μl/孔)。培養(yǎng)24 h后,用雙熒光素酶試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1干擾SNHG14對(duì)H2O2誘導(dǎo)的BB19細(xì)胞增殖和凋亡的影響 Model組BB19細(xì)胞中SNHG14表達(dá)、凋亡率和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)蛋白表達(dá)均明顯高于Con組,48、72 h OD值和Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯低于Con組(P<0.05)。Model+si-SNHG14組細(xì)胞中SNHG14表達(dá)、凋亡率和Bax蛋白表達(dá)均明顯低于Model+si-NC組,48、72 h OD值和Bcl-2蛋白表達(dá)均顯著高于Model+si-NC組(均P<0.05)。見表1、圖1、圖2。

圖1 各組細(xì)胞凋亡流式圖

1～8:Con組、Model組、Model+si-NC組、Model+si-SNHG14組、Model+miR-NC組、Model+miR-181b組、Model+si-SNHG14+anti-miR-NC組、Model+si-SNHG14+miR-181b Inhibitor組

表1 干擾SNHG14對(duì)H2O2誘導(dǎo)的BB19細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.2干擾SNHG14對(duì)H2O2誘導(dǎo)的BB19細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較,Model組BB19細(xì)胞中MDA含量明顯升高,SOD和CAT活性明顯降低(P<0.05)。與Model+si-NC組比較,Model+si-SNHG14組BB19細(xì)胞中MDA明顯含量降低,SOD和CAT活性明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 干擾SNHG14對(duì)H2O2作用的BB19細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

2.3SNHG14和miR-181b靶向關(guān)系的驗(yàn)證 SNHG14與miR-181b核苷酸序列的結(jié)合位點(diǎn)見圖3。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-SNHG14與miR-NC組、WT-SNHG14與miR-181b mimics組的熒光素酶活性(1.04±0.07 vs 0.26±0.03)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.739,P<0.05);共轉(zhuǎn)染MUT-SNHG14與miR-NC組、MUT-SNHG14與miR-181b mimics組的熒光素酶活性(1.01±0.05 vs 1.03±0.06)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.444,P=0.680),說明SNHG14可靶向結(jié)合miR-181b。同時(shí),轉(zhuǎn)染si-NC、si-SNHG14的BB19細(xì)胞中miR-181b表達(dá)量(1.00±0.02 vs 3.87±0.12)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=40.861,P<0.05)。

圖3 SNHG14靶向調(diào)控miR-181b表達(dá)

2.4過表達(dá)miR-181b對(duì)H2O2誘導(dǎo)的BB19細(xì)胞增殖和凋亡的影響 Model+miR-181b mimic組48、72 h OD值和Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯高于Model+miR-NC組,凋亡率和Bax水平均明顯低于Model+miR-NC組(P<0.05)。見圖1、圖2、表3。

表3 過表達(dá)miR-181b對(duì)H2O2誘導(dǎo)的BB19細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.5過表達(dá)miR-181b對(duì)H2O2誘導(dǎo)的BB19細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 Model+miR-181b mimic組BB19細(xì)胞中MDA含量〔(37.40±1.09)μmol/ml〕較Model+miR-NC組〔(68.31±2.54)μmol/ml〕顯著降低(t=19.370,P<0.05)。Model+miR-181b mimic組BB19細(xì)胞中SOD和CAT活性〔(77.73±3.74)、(25.26±1.02)U/L〕較Model+miR-NC組均顯著升高〔(55.91±2.70)、(12.88±0.37)U/L;t=8.193、19.762,均P<0.05〕。

2.6干擾miR-181b逆轉(zhuǎn)干擾SNHG14對(duì)H2O2誘導(dǎo)的BB19細(xì)胞增殖和凋亡的影響 Model+si-SNHG14+miR-181b inhibitor組BB19細(xì)胞48、72 h OD值、Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯低于Model+si-SNHG14+anti-miR-NC組,凋亡率和Bax蛋白表達(dá)均明顯升高于Model+si-SNHG14+anti-miR-NC組(均P<0.05)。見圖1、圖2、表4。

表4 干擾miR-181b逆轉(zhuǎn)干擾SNHG14對(duì)H2O2誘導(dǎo)的BB19細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.7干擾miR-181b逆轉(zhuǎn)干擾SNHG14對(duì)H2O2誘導(dǎo)的BB19細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 Model+si-SNHG14+miR-181b inhibitor組BB19細(xì)胞中MDA含量〔(54.90±1.76)μmol/ml〕較Model+si-SNHG14+anti-miR-NC組〔(29.14±1.00)μmol/ml〕,顯著升高(t=22.042,P<0.05)。Model+si-SNHG14+miR-181b inhibitor組BB19細(xì)胞中SOD和CAT活性〔(64.68±2.01)、(15.69±0.58)U/L〕較Model+si-SNHG14+anti-miR-NC組〔(90.06±3.66)、(30.09±1.50)U/L〕均顯著降低(t=10.528、15.509,均P<0.05)。

3 討 論

缺血性腦損傷是老年人群的常見疾病,嚴(yán)重影響老年人的身心健康。活性氧自由基可引起腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,導(dǎo)致缺血性腦損傷的發(fā)生。H2O2是活性氧自由基中的一種,其可攻擊生物膜引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng),破壞生物膜的完整性,降低細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性,引起細(xì)胞損傷〔9〕。本研究結(jié)果表明,H2O2誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型建立成功。

作為一種lncRNA,SNHG14參與多種疾病的發(fā)展進(jìn)程。研究顯示,干擾SNHG14表達(dá)可靶向miR-133b下調(diào)人α-突觸核蛋白(syn)表達(dá)減輕魚藤酮誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元損傷,從而有助于改善帕金森病的嚴(yán)重程度〔10〕;干擾SNHG14表達(dá)降低了脂多糖誘導(dǎo)的小鼠肺泡巨噬細(xì)胞(MH-S)中IL-18、IL-1β、TNF-α和IL-6等炎性因子表達(dá),其可作為急性肺損傷的治療靶標(biāo)〔11〕;SNHG14在急性腦梗死患者血清中表達(dá)升高,其高表達(dá)與患者病情嚴(yán)重程度密切相關(guān),其診斷急性腦梗死診斷的ROC曲線下面積為0.708,敏感性為80.74 %,特異性為57.78 %,是影響急性腦梗死發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔12〕。干擾SNHG14表達(dá)可靶向miR-136-5p并下調(diào)ROCK1的表達(dá)增強(qiáng)氧糖剝奪誘導(dǎo)的神經(jīng)元活性且抑制其炎癥反應(yīng),減輕了神經(jīng)元損傷,SNHG14可能是治療缺血性腦卒中的新靶點(diǎn)〔13〕。但目前,SNHG14對(duì)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響和作用機(jī)制還未知。

氧化應(yīng)激是腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的病理機(jī)制之一。MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物,其可以攻擊細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸,進(jìn)而引起細(xì)胞損傷。MDA水平可間接反映細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度及受損程度〔14〕。SOD和CAT均是抗氧化酶,其中SOD可減輕自由基對(duì)機(jī)體組織損傷〔15〕;CAT可降H2O2分解為水和氧氣,降低氧化反應(yīng)水平。本研究結(jié)果說明,干擾SNHG14可抑制H2O2誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激可進(jìn)一步誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,加劇腦組織損傷。Bax是促凋亡分子,而Bcl-2發(fā)揮抑凋亡作用〔16〕。本研究結(jié)果表明,干擾SNHG14可以緩解H2O2誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

此外,本研究說明,SNHG14靶向負(fù)調(diào)控miR-181b,這也與本文H2O2促進(jìn)了腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中SNHG14的表達(dá)而抑制了miR-181b的表達(dá)的結(jié)果一致。miR-181b參與多種疾病的發(fā)展進(jìn)程。研究顯示,動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中miR-181b呈低表達(dá),miR-181b表達(dá)的下降可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)源性位點(diǎn)缺口同源蛋白(Notch)1引起動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成和血管內(nèi)皮損傷〔17〕;過表達(dá)miR-181b可減輕低氧誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞HK-2凋亡并抑制腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá),參與調(diào)節(jié)腎臟移植腎損傷過程〔18〕;上調(diào)miR-181b可通過調(diào)控輸入蛋白α3/核因子(NF)-κB途徑減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷〔19〕。本研究結(jié)果提示,干擾SNHG14通過靶向負(fù)調(diào)控miR-181b來減輕H2O2誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。

綜上,SNHG14在H2O2誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)增加,干擾SNHG14促進(jìn)H2O2誘導(dǎo)的腦血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,減少細(xì)胞凋亡,同時(shí)抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激,這可能與干擾SNHG14導(dǎo)致細(xì)胞中miR-181b表達(dá)上調(diào)有關(guān)。